1 背景介绍
在人类细胞中，长达2米的DNA被压缩在5微米的细胞核中。细胞通过DNA在周围的组蛋白进行分层折叠的方式形成核小体，然后核小体压缩行程染色质。这个分层压缩的机制将不活跃的基因组区域封存，并将生物学活性区域保留在转录机制中，包括启动子，增强子以及其他的调控因子。在物理压缩的基础上，衍生出一套操控表观遗传的密码，包括DNA甲基化、核小体定位、组蛋白组成和修饰以及转录因子、染色质重构和非编码RNA。表观遗传学机制通过控制染色质的组成、压缩以及核蛋白的结构来管理细胞的表现型。
ATAC-seq（Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing）通过极度活跃的Tn5转座酶对可及性增强区剪切，同时将剪切位点和高通量测序的转接头进行链接。然后通过一定的方法对高通量测序的数据集进行生物信息学分析。
但是bulk ATAC-seq无法识别样本中某个细胞亚群的染色质状态，为了研究异质群体中的开放染色质，需要将ATAC-seq精确到单细胞水平。2015年，Greenleaf 实验室和Shendure实验室几乎在同一时间分别在《自然》和《科学》杂志上发表了他们关于ATAC-seq在单细胞领域的应用。
自此一些自制的方法和技术的改进开始出现，其中10X Genomics和BioRad两家公司提供了进行单细胞scATAC检测的特定设备和试剂。
这里，我们将会基于10X Genomics的方案进行后续对于scATAC-seq的研究。
2 ATAC-seq术语入门：
fragment在ATAC-seq的实验中是一个很重要的概念，它指的是通过Tn5转座酶对DNA分子进行酶切，然后经由双端测序得到的序列。基于Tn5的插入偏移量来推断fragment起始和终止的单碱基位置。根据之前的报道，Tn5转座酶与DNA耦合成同源二聚体，两个Tn5转座酶之间有9bp的DNA序列。因此，每个Tn5二聚体结合事件都会导致两个insertion的诞生，并且两者之间间隔9bp。所以，真实的“开放”位点的中心位于Tn5二聚体的正中间，而不是每个Tn5 insertion的位置。为了表明这一点，ArchR对每一个insertion引入一个偏移量，即正链的insertion事件+4pb，负链的instertion事件-5bp。因此，在ArchR软件中，“fragment”是指一个储存着染色体、偏移量校正过的染色体起始位置、偏移量校正过的染色体终止位置和与每一个测序得到的fragment相对应的唯一细胞barcode ID等信息的table或者genomic ranges对象。同理，“insertions”是指偏移量矫正过的开放性中心位置的碱基的位置。
3 上游 CellRanger-atac细胞计数分析
CellRanger-atac是10X Genomics官方开发的一款分析软件，用于对10X scATAC数据进行分析。其中包括mkfastq、count、aggr和reanalyze4个模块，分别用来进行fastq文件的制作、细胞计数与分析、数据整合以及重分析等内容。
mkfastq模块生成的数据包含4个文件：
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 142291345 May 23 2019 atac_pbmc_500_nextgem_S1_L001_I1_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 534722058 May 23 2019 atac_pbmc_500_nextgem_S1_L001_R1_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 293893750 May 23 2019 atac_pbmc_500_nextgem_S1_L001_R2_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 531397588 May 23 2019 atac_pbmc_500_nextgem_S1_L001_R3_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 142683281 May 23 2019 atac_pbmc_500_nextgem_S1_L002_I1_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 535094456 May 23 2019 atac_pbmc_500_nextgem_S1_L002_R1_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 293635305 May 23 2019 atac_pbmc_500_nextgem_S1_L002_R2_001.fastq.gz
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 530537382 May 23 2019 atac_pbmc_500_nextgem_S1_L002_R3_001.fastq.gz
R1、R2、R3和I1分别储存有read1、barcode、read2和index的信息。
使用count模块进行细胞计数和分析，会得到如下的结果文件：
drwxr-xr-x 6 yangyupeng research 4 Mar 24 15:39 analysis
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 98741609 Mar 24 15:39 cloupe.cloupe
drwxr-xr-x 2 yangyupeng research 3 Mar 24 15:39 filtered_peak_bc_matrix
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 7729733 Mar 24 15:39 filtered_peak_bc_matrix.h5
drwxr-xr-x 2 yangyupeng research 3 Mar 24 15:39 filtered_tf_bc_matrix
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 468852 Mar 24 15:40 filtered_tf_bc_matrix.h5
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 105588773 Mar 24 15:39 fragments.tsv.gz
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 870802 Mar 24 15:39 fragments.tsv.gz.tbi
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 2173719 Mar 24 15:39 peak_annotation.tsv
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 1142625 Mar 24 15:39 peaks.bed
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 2912261728 Mar 24 15:39 possorted_bam.bam
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 4216136 Mar 24 15:39 possorted_bam.bam.bai
drwxr-xr-x 2 yangyupeng research 3 Mar 24 15:39 raw_peak_bc_matrix
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 12377086 Mar 24 15:39 raw_peak_bc_matrix.h5
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 14393663 Mar 24 15:39 singlecell.csv
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 1132 Mar 24 15:40 summary.csv
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 6157 Mar 24 15:39 summary.json
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 23928396 Mar 24 15:39 test.rds
-rw-r--r-- 1 yangyupeng research 1842305 Mar 24 15:39 web_summary.html
| File Name | Description |
|---|---|
| analysis | 分析产生模块产生的分析结果 |
| cloupe.cloupe | Loupe Browser的输入文件 |
| filtered_peak_bc_matrix | 过滤后的peak barcode矩阵 |
| filtered_peak_bc_matrix.h5 | 过滤后的peak barcode的hdf5格式矩阵 |
| filtered_tf_bc_matrix | 过滤后的转录因子barcode矩阵 |
| filtered_tf_bc_matrix.h5 | 过滤后的转录因子barcode的hdf5格式矩阵 |
| fragments.tsv.gz | barcode和比对上的片段文件 |
| peak_annotation.tsv | peak注释文件 |
| peaks.bed | 所有被鉴定出的peak的位置文件 |
| possorted_bam.bam | 位置排序的bam文件 |
| raw_peak_bc_matrix | 原始的peak barcode矩阵 |
| raw_peak_bc_matrix.h5 | 原始的peak barcode的hdf5格式矩阵 |
| singlecell.csv | 每个片段的条形码计数矩阵 |
| summary.csv | 数据指标总结文件，csv格式 |
| summary.json | 数据指标总结文件，json格式 |
| test.rds | seurat对象储存文件 |
| web_summary.html | HTML文件，数据指标总结和分析结果展示 |
4 下游分析：
可以用于分析scATAC的软件有很多，但是每个软件的功能却不尽相同。很多时候需要使用多款软件才能对数据进行一个比较全面的分析，但是各个软件的使用的数据格式有差别，导致数据的转换成为难点。基于此，我们这里选用了功能最为齐全的ArchR作为我们分析是使用的主软件基于cellranger-atac的结果进行下游的分析，下表列出了13款软件的功能对比。
| Tool | ChromVAR | SCRAT | scABC | Cicero | Scasat | cisTopic | snapATAC | epiScanpy | Destin | SCALE | scATAC-pro | Signac | ArchR |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Platform | R | R/Web | R | R | Python/R | R | Python/R | Python | R | Python | Python/R | R | R |
| Feature Matrix | TF motifs, k-mer | Selectable feature | Peak | TSS | Peak | Peak | Bin, peak | Peak | Peak | Peak | Peak | Peak | Bin, peak |
| Preprocessing | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O |
| Clustering | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O | O |
| DAR | X | O | X | O | O | X | O | X | O | O | O | O | O |
| Motif/k-mer | O | X | O (ChromVAR) | X | X | X | O (ChromVAR, Homer) | X | X | O (ChromVAR) | O (ChromVAR) | O (ChromVAR) | O (ChromVAR), TF footprinting |
| Gene activity | X | X | X | O | X | O | O | X | X | X | O | O | O |
| Co-accessibility | X | X | X | O | X | X | X | X | X | X | O (Cicero) | X | O |
| Trajectory | X | X | X | O | X | X | X | X | X | X | X | X | O |
| Pathway | X | X | X | X | O (GREAT) | O | O (GREAT) | X | X | X | O (GREAT) | X | X |
| Enrichment analysis | X | X | X | X | X | O | X | X | O | X | X | X | O |
| scRNA integration | X | X | X | X | X | X | O (Seurat) | X | X | X | X | O (Seurat) | O (Seurat) |
| Reference | [3] | [4] | [5] | [6] | [7] | [8] | [9] | [10] | [11] | [12] | [13] | [14] | [15] |
4.1 ArchR软件包
ArchR(single-cell Analysis of Regulatory Chromatin in R)是一个用于分析scATAC-seq数据的功能全面的R软件包。它可以分析多个来源的单细胞ATAC数据，比如：10X Genomics系统、Bio-Rad droplest scATAC-seq系统、single-cell combinatorial indexing和Fluidigm C1系统。这款软件的提供了用户在分析scATAC数据时比较关心的分析内容，比如：marker基因的鉴定、转录因子足迹分析、交互排序轨迹可视化、与scRNA-seq数据整合分析以及细胞轨迹分析等。
另外，ArchR加入了双细胞识别功能。双细胞是由于在一个油包水中混入了2个细胞导致的，会给我们的数据分析带来一定的麻烦，可能会引入错误的cluster或者细胞类型之间的联系。所以ArchR加入了双细胞的识别和过滤功能，以此来提高我们数据的准确性。
相比于其他分析软件，ArchR通过优化数据结构降低了内存的消耗，并且使用并行策略提高了运行速度。需要注意的是，ArchR的并行策略是基于Unix系统提出的，目前的没有针对windows的并行优化，即在windows系统上运行ArchR只能进行单线程分析。所以，在进行大型数据分析的时候，还是需要在unix服务器上进行的。
ArchR的分析基础是Arrow文件。每个Arrow文件都储存着单个样本的所有信息。在创建Arrow文件以及以及进行附加分析的时候，ArchR会实时编辑和更新Arrow文件，在其中添加相关信息层，并且将Arrow文件输出到磁盘空间中，以此来减少对内存的依赖，降低分析时的硬件要求。实际上Arrow就是一个存放在磁盘上的一个HDF5格式的文件。ArchR使用ArchR对象来和Arrow文件关联到单个分析框架下，然后通过直接或间接的方式读取和编辑Arrow文件，从而保证了R能够高效的访问它们。ArchR对象时存放在R内存中的，但是由于大量信息储存在Arrow文件中，该对象所需内存大大减少。
参考文献：
[1] Buenrostro JD, Wu B, Chang HY, Greenleaf WJ. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 2015;109:21.29.1-21.29.9. Published 2015 Jan 5. doi:10.1002/0471142727.mb2129s109
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[6] Pliner HA, Packer JS, McFaline-Figueroa JL, Cusanovich DA, Daza RM, Aghamirzaie D, Srivatsan S, Qiu X, Jackson D, Minkina A, et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Mol Cell 2018;71:858–71 e8.
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