T6SS-主要结构蛋白及机制

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T6SS效应蛋白介绍

T4SS生物学功能与研究技术

T4SS生物学功能以及研究方法

T4SS的底物类型及转移方式

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T6SSs 标志性蛋白:

蛋白 VgrG 和 Hcp 可以在 T6SS 激活菌株的上清中被检测到,因此将这两种蛋白的分泌当做 T6SS 活性功能得以实现的标志.

而溶血素共调节蛋白 (Hamolysin-coregulated protein,Hcp ) 和 缬 氨 酸-甘氨酸重复蛋白 G ( Valine-glycine repeat proteinG,VgrG) 的蛋白同时是 T6SS 的组成部分和效应蛋白。Hcp 蛋白会聚集成一个六聚体环状结构,为潜在的细菌蛋白分泌构成一个调节孔。VgrG 蛋白与三聚体噬菌体 T4 尾部刺突蛋白同源,也会聚集成一个三聚体与 Hcp 蛋白相联。由此,VgrG 蛋白得以从细菌表面延伸到真核宿主细胞膜表面,从而使效应因子直接转移到宿主细胞质内。

溶血素协同调节蛋白(haemolysin coregulated protein, Hcp):

负责细菌 T6SS 中多种效应因子的转运,是一种结构类似于 T4 噬菌体尾管 gp19 的蛋白,由六聚体环堆叠在外,该六聚体形式参与构成 T6SS 的内管,同时 Hcp 六聚体的堆叠需要 VgrG 和周围 TssBC 鞘的组装。

① 最初在霍乱弧菌中发现,并根据其与溶血素的协同调节命名;

② 一种分泌蛋白外,在不同的细菌中具有多种功能(抑制巨噬细胞的吞噬作用,促进肌动蛋白的重排、细胞凋亡和细胞因子的释放以及细菌的粘附和侵袭等);

③ 内径为40 Å 的同六聚体,作为T6SS的结构分泌组分,形成效应子输送内管;

④ T6SS效应子的重要的伴侣蛋白,可防止效应子降解,与Hcp结合一起分泌到宿主细胞体内.

缬氨酸-甘氨酸重复 G 蛋白(valine-glycine repeat G, VgrG):

VgrG 是一个三聚体结构,位于 T6SS 管道结构的尖端。 VgrG 与 T4 噬菌体尾部穿刺结构同源,也称为针状或尖端结构. 两种大肠杆菌VgrG蛋白的N和C端片段的独立结构证明,VgrG具有与gp27/gp5 复合物高度相似性的结构,形成T4噬菌体的 β棱镜尾尖。

① VgrG 蛋白由三部分构成,分别是:gp27 区域、gp5 区域及可变的活性区域。其中 VgrG 的 C 末端延伸区域与噬菌体尾端的 gp5 同源,为假定的效应因子活性区域,含有可变的活性区域,与效应因子的分泌相关,许多 VgrG 同源物带有一个广泛的 C 末端假定效应域,C 端扩展区域既可作为效应因子输出又可作为受体与相应效应因子结合,并可将之转运到宿主靶细胞内,这些效应因子可以作为致病因素发挥作用。一些 VgrG 蛋白拥有不同的 C 末端延伸域,使其有不同的功能活性,如铜绿假单胞杆菌中 VgrG 携带一个锌离子结合域,而霍乱弧菌中 VgrG 含有重复的结构性毒素 A。

N末端蛋白与 T6SS 系统的组成相关,Vgr G三聚体结构以与 T4 噬菌体相似的方式组合成(gp27)3-(gp5)3 复合物的结构,Vgr G 的N 末端蛋白虽然与(gp27)3-(gp5)3 复合物的序列相似性不是很高,但是结构相似性极高。T6SS 独特的针尖状结构由 gp5 域构成,gp5 的溶解酶活性可以局部溶解细胞壁,使其具有穿透细胞的能力。gp27 蛋白在噬菌体中作为尾部纤维蛋白,使噬菌体可以特异性结合细菌受体。

② 发现含有PAAR重复序列的蛋白(通常在VgrG基因的下游编码)与VgrG三聚体的末端结合,在排出的Hcp-VgrG穿孔结构的末端形成最终的尖锐圆锥形结构。核酸酶效应因子可借助 PAAR 复合域绑定到 VgrG 尖端转运到宿主靶细胞中,即 vgrG 在有机体中可介导效应分子的易位。最近有研究指出,基因 rhsA 和基因 rhsB 编码的两个不同的核酸酶可在 vgrG 介导下传递到靶细胞中,而 rhsA、rhsB 均含有 PAAR 重复蛋白域,最初被命名为TagD的PAAR蛋白能够特异性作用于其同源VgrG蛋白,并且可能在T6SS装配中发挥重要作用,因为不动杆菌中所有PAAR白的缺失导致Hcp的分泌和毒性作用几乎完全丧失.T6SS效应分子伴侣(effector chaperone,TEC)或衔接蛋白(adaptor ,Tap-1)是通过与VgrG和效应蛋白结合进行毒素装载和转运的必要蛋白质。

③ VgrG 尖端一旦与宿主靶细胞接触,即可刺穿宿主靶细胞膜,然后 VgrG 尖端与 Hcp 管道脱落,效应分子就被释放进入宿主靶细胞内。VgrG尖端结合效应因子的途径有三种:第一,结合到 VgrG 的 C 末端延伸域;第二,结合到 VgrG 表面特定区域;第三,结合到 VgrG 尖端 PAAR 复合域氨基末端。总的来说,VgrG 群岛参与毒力、抗菌、竞争及细菌进化等过程。

TssBC收缩鞘机制

ClpV是一种细胞质AAA+ATP酶蛋白,它通过识别TssC的N端螺旋,以ATP依赖性方式诱导TssBC收缩鞘的分解。ClpV特异性结合于收缩的收缩鞘,使得T6SS组件可以回收。收缩鞘收缩后,TssBC结构域的构象变化暴露出鞘表面的TssC的N端,从而被ClpV识别。

ClpV具有被中间结构域隔开的N端和两个AAA结构域,其一级序列与ClpB约35%相同,后者参与大蛋白聚集体的分解。ClpV的N末端结构域由八个α螺旋组成,在结构上与ClpA/B/C相似,但包含参与VipB结合的ClpV特异性N末端α螺旋。VipB的N端α螺旋在延伸的鞘管上无法进入ClpV,但在收缩后暴露在鞘管表面上,暴露VipB的N-末端用于ClpV结合。

在一些T6SS中,例如铜绿假单胞菌的H1-T6SS,鞘管再循环更加复杂。铜绿假单胞菌ClpV的N-末端结构域的结构与霍乱弧菌ClpV的结构不同。其ClpV N末端结构域不与VipB N末端的结合,表明鞘循环的机制不同,ClpV–VipB相互作用导致收缩鞘的初始碎裂,从而暴露收缩鞘的自由端,TagJ/ClpV的随后进行完全分解。

TssBC收缩鞘提供大量ATP能量

1μm长的T6SS鞘由大约1500个鞘亚基组成,则单次收缩的总能量是18,000 kcal mol−1。根据生长条件,一个ATP分子水解释放的能量约为11.2 kcal mol-1。因此,TssBC收缩鞘释放的能量相当于1600分子ATP水解。

底物转移的速度也很快。由于收缩鞘会缩至其原始长度的约50%,因此长度为1μm的平均收缩鞘以至少100μm/s的速度移动VgrG/PAAR/effector。驱动蛋白以约0.5μm s-1的速率移动,并且每8nm消耗约一个ATP分子。此外,内管的尖端在离开底板时旋转。每分钟最多可达12万转。TssBC收缩鞘收缩期间释放的能量以及有效载荷移动和旋转的速度非常显著,这表明T6SS可以携带大量底物。

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