单细胞技术为研究人员提供了重要的帮助，无论实在实验室还是在临床上。大多数的研究人员都能在研究中熟练使用单细胞方法技术的流程和分析，如无监督聚类、系统发生、轨迹推断、RNA速率分析、谱系追踪和配体受体相互作用映射等。但是，对于高维单细胞方法如何被研究肿瘤细胞和它们的微环境之间的相互作用，特别是它如何与抗癌免疫治疗反应相关，可能还缺乏一定的了解。今年四月份发表在Nature reviews. Clinical oncology（IF:66.674）的一篇综述可能为我们提供帮助。
Applying high-dimensional single-cell technologies to the analysis of cancer immunotherapy
背景介绍
肿瘤是恶性细胞、免疫细胞和间质细胞的复杂混合物，通常具有相当程度的瘤内和瘤间异质性。肿瘤微环境(TME)包括促肿瘤和抗肿瘤信号的混合物，能够调节肿瘤生长和影响肿瘤进化。Bulk基因组和转录组分析为这些过程提供了有价值的见解，但是，在bulk水平上，获取的是大量细胞平均后的信号，往往掩盖了特定的亚群或细胞状态。
事实上，罕见和独特的细胞亚型或状态可能在疾病生物学中发挥重要作用，如潜在的癌症干细胞、对治疗反应至关重要的免疫细胞等，这些可能无法在bulk水平的分析中检测到，但是对于癌症免疫治疗、新免疫疗法或获得性耐药性反应至关重要。
几十年来，人们已经认识到单细胞分析的巨大力量。并且单细胞方法有助于回答许多肿瘤免疫学中持续存在的问题，如：肿瘤和免疫细胞异质性的作用(包括抗原提呈机制表达的异质性)；T细胞克隆型与表型的关系；TME中存在的免疫-检查点相互作用网络；肿瘤细胞与免疫细胞之间以及不同免疫细胞类型之间的空间功能关系。
这篇综述的重点主要有一下几个方面：
高维单细胞分析如何被用来研究肿瘤细胞和它们的微环境之间的相互作用，特别是它如何与抗癌免疫治疗的反应有关。
单细胞转录组学、蛋白质组学、表观基因组学和基因组技术如何改变我们对抗癌免疫治疗的响应性和耐药性的理解，
整合多种模式的分析方法，
单细胞T细胞受体(TCR)分析的关键重要性。
单细胞空间分析成为新兴技术，重点是它们在免疫肿瘤学中的适用性。
讨论单细胞技术的未来发展方向及其在促进免疫肿瘤领域的潜在作用。
Fig.1 免疫肿瘤学的单细胞分析流程
第一章：单个细胞组学分析
一、转录组学：
单细胞RNA测序(scRNA-seq)是指一组技术，能够对存在于单个细胞中的转录本进行非靶向量化。作为一种非靶向的研究转录组的方法，scRNA-seq可以识别新的细胞类型，确定罕见细胞亚群，并定义细胞状态和系统发育的谱系（图1）。在下面的小节中，将详细讨论几个足以说明scRNA-seq价值的例子。
1、 肿瘤细胞和免疫应答
通过scRNA-seq分析，无论是在个体肿瘤间还是个体肿瘤内部，肿瘤异质性是肿瘤细胞主要特征。这种患者-患者的异质性使利用肿瘤细胞的scRNA-seq来研究治疗应答变得复杂。因此，在识别与患者共享的免疫治疗反应相关的细胞类型和状态方面，免疫细胞和基质细胞的单细胞分析取得了更丰硕的成果。（PS：所以，肿瘤微环境是近两年研究的热点，也将是接下来研究的重点。如果无法从复杂的肿瘤细胞中获得成果，不妨试试肿瘤微环境。）
尽管存在这种异质性，但用患者共有的特定转录状态识别恶性细胞是可能的。对单个肿瘤细胞转录组的研究已经细化了肿瘤类型及其细胞层次的分类，也使能够识别与治疗反应或耐药性相关的转录组全范围的特征。
2、免疫细胞/基质细胞和免疫应答
总的来说，全面了解免疫细胞的组成和状态对于理解当前免疫应答和耐药性，以及合理设计新的免疫调节疗法和组合至关重要。这一领域的初步努力是构建非恶性肿瘤组织中细胞的详细免疫图谱，然后将这些图谱和方法应用于肿瘤环境。
将单细胞转录映射扩展到一系列肿瘤类型的TME，揭示了一些关于癌症免疫反应的异质性和多样性的有趣见解。一个重要的发现是，基于细胞状态的非靶向转录评估的聚类往往不能根据细胞表面蛋白表达清晰地划分为传统的免疫细胞亚群，从而导致对免疫细胞在TME中的作用有更微妙的理解。
在免疫治疗的背景下，将这些方法应用于TME中存在的免疫细胞和基质细胞，可以阐明对免疫治疗(如ICIs)产生应答和耐药性的转录状态。更重要的是，绘制多种肿瘤类型免疫landscape的分析已经发现了一个新生的、但正在增长的、与淋巴细胞、DC、单核细胞、巨噬细胞和成纤维细胞室对免疫治疗反应相关的转录状态组合，其中很多都被当作公认的生物标志物来研究。
3、互作分析
许多研究已经探索了肿瘤细胞或免疫细胞和/或基质细胞的作用，尽管这些细胞类型之间和内部的复杂相互作用在癌症生物学中具有关键作用。这些重要的细胞-细胞相互作用的信息可以从scRNA-seq数据中推断出来，通过关联不同细胞类型之间的配体-受体对的表达。例如，张泽民老师团队对细胞相互作用的评估为肿瘤相关的树突状细胞和外周T细胞之间的互作提供了见解。
Fig.2 张泽民老师团队对免疫细胞互作的研究
[Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma. Cell. 2019 41.582]
而新的技术正在开发的方法，能够探索物理细胞-细胞相互作用，如在空间上解析scRNA-seq的方法——试图更好地理解肿瘤细胞和TME之间复杂的相互作用。这些都是今后研究者可以努力的方向。
4、scRNA-seq的局限
尽管scRNA-seq也有一定的缺陷，但它已经彻底改变了细胞类型和细胞状态的描述。scRNA-seq数据本质上是嘈杂的，因为真核生物的转录并不以一致的基础速率进行。
所以对于我们拿到的单细胞数据中的0值，这些0值出现有两种完全相反的可能——1.这些基因在细胞中本身就是不活跃的；2.该基因是活跃的，但是由于细胞转录动态学和采样时间的烟瘾，转录本并没有被检测到，或者由于技术原因，导致该基因的表达没有被检测到。
不过通过考虑整个转录组的情况，可以帮助解决这个局限——如通过差异表达基因的进行聚类。因此，对单细胞结果的解释应该集中在pathway分析和基因集富集上，而不是任何单一基因的表达或影响。
其次，仅使用转录组数据来建立基因型和表现型之间的相关性仍然具有挑战性。例如，scRNA-seq数据被用来推断体细胞拷贝数变异(通常称为sCNVs)，但这只适用于相对较大的缺失或扩增。而对于sSNVs评估比sCNVs需要更高的分辨率，且现今来讲，置信度仍旧是一个挑战。因此，在评估个体肿瘤细胞的体细胞突变对治疗反应或耐药性的影响时，scRNA-seq方法是一种不理想的方法。
除了scRNA-seq的这些固有局限性之外，与样品和处理相关的具体细节也会影响结果，以及在不同的时间处理样品，即使有轻微的技术差异，也会出现批效应，需要有效的方法来避免这些误差。
二、蛋白组学
1、质谱流式细胞术
单细胞蛋白质组学研究主要依赖于使用抗体或类似亲和试剂进行选择性靶标检测。长期以来，在单细胞分辨率水平上，流式细胞术一直是研究人员评估蛋白表达的主要手段，尽管可以同时检测到的表位的数量受到荧光团之间光谱重叠的限制。
2、单细胞蛋白质组分析的新兴技术
下一代光谱分析仪有望将基于荧光的流式细胞术的能力扩展到可与大规模细胞术相媲美的水平。这些系统相对于大规模细胞检测的优势是,能够利用大量荧光标记抗体，因为它们不像大规模细胞检测那样破坏细胞，因此能够在后续实验中对细胞进行分离和分类。这些光谱分析仪和微流体系统的新平台仍处于开发的早期阶段，需要在其他临床环境中进行验证。尽管如此，它们将在免疫肿瘤学中发挥越来越重要的作用。
三、基因组学
对单细胞进行全基因组和全外显子组测序的方法已经开发出来，尽管这些方法尚未过渡到高维分析，最主要的原因是这种测序的成本过高，限制了大规模的对每个患者进行大量细胞的测序。一种更有效的方法是：首先使用bulk肿瘤DNA样本的深度测序来识别sSNVs，然后使用单细胞DNA的靶向测序来检测假定的driver突变或克隆结构中涉及的突变。尽管该系统尚未应用于免疫治疗，但已用于分析数十万单个细胞，通过急性髓系白血病患者的诊断、缓解和复发追踪特异性突变，从而证明了该技术的前景。
四、表观基因组学
表观基因组分析方法，如转座酶染色质测序(ATAC-seq，它可以检测染色质的开放片段)，基于亚硫酸氢盐的DNA甲基化测序，染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq，检测DNA蛋白质相互作用)和染色体构象捕获(如3C和Hi-C)，都已适用于单细胞分析。在这些方法中，scATAC-seq是目前唯一的高通量测序方法，因此被广泛使用。随着测序技术的不断进步，单细胞表观基因组学是一个快速发展的领域，特别是当与单细胞转录组学结合时，很可能成为肿瘤单细胞分析的下一个主要进展之一。
五、多模式分析
研究人员对于将不同的单细胞分析模式整合到综合技术中的兴趣正在增加。下面简要回顾了几种具有广泛适用性的、具有前景的方法，但迄今为止，这种多模式方法在研究对免疫应答方面的应用仍受到限制，需要研究人员的不断努力。
1、RNA/DNA+蛋白
使用与条形码寡核苷酸结合的抗体，将单细胞蛋白质检测技术和scRNA-seq协议（如 CITE-seq 和 REAP-seq）结合，通过 scRNA-seq 的 cDNA 测序步骤检测基于蛋白质的标记，从而使蛋白质检测不受光谱重叠或可解析金属离子数量的限制。将基于抗体的数十到数百种蛋白质的检测添加到非靶向转录组分析中的能力，通过在传统免疫学的框架内定义转录簇和减少由转录退出引起的歧义，大大提高评估TME的能力。
2、谱系追踪
scATAC-seq数据包含来自线粒体基因组的测序read。尽管这些信号最初被视为实验性干扰，但此功能可以检测可用于进行克隆追踪的线粒体突变。因此，scATAC-seq 能够同时测量细胞谱系（通过线粒体基因组）和细胞命运（通过核表观基因组）。线粒体突变也可以在scRNA-seq 数据中检测到，但由于线粒体基因组的覆盖范围较低且不一致，因此不如 scATAC-seq 数据中的检测那么有效。这种谱系追踪分析可以在未来应用，以更好地了解哪些肿瘤细胞克隆响应特定治疗而扩大或收缩，从而哪些克隆可能与治疗耐药性有关。
第二章：单细胞TCR分析
T细胞是适应性免疫系统的主要分支，负责抗肿瘤免疫，因此是大多数FDA批准的癌症免疫疗法的主要焦点。所以，单个T细胞克隆型的分析是目前越来越多研究人员的兴趣所在，是目前该领域的热点所在。
TCR是由两条链组成的异源二聚体，其基因重组产生了多样化的TCR库。大多数T细胞(95%)携带单独的TCR α和β亚基，它们共同识别同源肽MHC抗原。基于这种TCR多肽MHC相互作用，在免疫原性肿瘤中自然发生的TILs（肿瘤浸润淋巴细胞）具有消除肿瘤的潜力。确定T细胞能否靶向肿瘤细胞，需要单细胞配对的TCR α和β亚基序列用于TCR重构和特异性检测。
此外，为了使免疫疗法产生有效的抗原特异性抗肿瘤免疫反应，肿瘤抗原最终必须作为抗原MHC复合物呈递，并被肿瘤浸润T细胞上的同源TCR识别。越来越多的证据表明，许多肿瘤浸润T细胞只是“旁观者”，无法识别和攻击肿瘤细胞。肿瘤可能表现为免疫效应细胞的高度浸润，但由于缺乏具有抗肿瘤活性的肿瘤特异性T细胞，因此，肿瘤在性质上是冷的。通过量化细胞组成和表征转录状态，单细胞方法还可以识别成对的α和β亚基，这是确定浸润T细胞特异性的关键步骤。这些信息不仅有助于解释当前免疫疗法的耐药性（例如缺乏肿瘤特异性），还有助于发现可用于新型工程化TCR细胞疗法的高亲和力抗肿瘤TCR。
第三章：高维空间分析
肿瘤免疫微环境的空间高变异性越来越被认为是导致大多数癌症类型的异质性和治疗反应变化多端的原因。空间方法可以追溯到Coons等人的免疫组化和免疫荧光对蛋白进行选择性免疫染色和Gall和Pardue等人的核酸序列的原位杂交，它们已经成为癌症诊断、分类、治疗选择和预测不可或缺的方法。在过去的几年里，随着生物信息学的进步，这些更传统的方法得到了极大的扩展，使同时可视化蛋白质、DNA、RNA分子成为可能。还在开发几种将空间分辨率与下一代测序结合起来的方法，如：
Fig.3 高维空间分析方法
尽管技术上仍处于初步阶段，空间分辨率的多路分析方法却正在重塑细胞间互作和肿瘤细胞、TME细胞之间的研究方式，而肿瘤的TME控制着肿瘤免疫和患者的免疫应答。
第四章：未来方向
scRNA-seq及其多种多样的模式是革命性的研究工具，正在推进对人类癌症免疫学的理解，以及驱动患者对免疫治疗的反应性和耐药性的机制。尽管免疫疗法已经改变了许多晚期恶性肿瘤的治疗，但大多数患者要么对这些药物无效，要么最终获得耐药性。
大量的临床试验正在探索免疫治疗的联合方法，这些研究已经完成或者这在进行。尽管如此，克服原发性和获得性耐药性的合理免疫治疗组合，需要对每种癌症类型的肿瘤免疫微环境进行全面表征，以及在治疗过程中对有效抗肿瘤免疫的决定因素的详细理解。单细胞技术能够全面分析TME，因此特别适合研究肿瘤和免疫细胞的异质性，以及肿瘤生物学中的这种差异如何有助于治疗耐药。
然而在临床上看来，许多技术太过于昂贵，因此必须考虑需要收集样本的类型、形式、最佳收集时间等。虽然具有挑战性，但从相对较少的患者的深入调查中，大样本的分析更有效、也能提供更直接的见解(图4)。
Fig.4在涉及免疫治疗的临床试验中纳入单细胞分析
结束语
分子生物学、微流体技术和生物信息学的进展，研究人员逐渐能够在单细胞水平上研究数以千计的恶性肿瘤细胞、免疫细胞、基质细胞的基因组、转录组、表观基因组和蛋白质组学。高维、多方面的特征能够解剖肿瘤异质性、肿瘤细胞及其微环境之间复杂的相互作用，以及肿瘤进化轨迹的细节。这篇综述通过单细胞转录组学、基因组学、蛋白组学、TCR以及高维空间组学等方面，详尽的讲述了单细胞技术在免疫治疗中的可行性，以及今后研究者的研究方向，为我们了解单细胞应用癌症免疫治疗提供了很大的帮助。
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