简单的转录组差异基因表达分析 -- DESeq2

经典的转录组差异分析通常会使用到三个工具limma/voom, edgeR和DESeq2。今天我们就通过一个小规模的转录组测序数据来演示DESeq2的简单流程。

文中使用的数据来自Standford 大学的一个拟南芥的small RNA-seq数据（https://bios221.stanford.edu/data/mobData.RData）

该数据包含6个样本：SL236，SL260，SL237，SL238，SL239，SL240，并分成了三组，分别是：

MM="triple mutatnt shoot grafted onto triple mutant root"

WM="wild-type shoot grafted onto triple mutant root"

WW="wild-type shoot grafted onto wild-type root"

简而言之，WW组可以认为是实验的对照组，而MM和WM则是两个处理组。

对于DESeq2的分析流程而言，我们需要输入的数据包括：

表达矩阵（countData）
分组信息（colData）
拟合信息（design）：指明如何根据样本的分组进行建模

下面就以mobData 中的数据为例简单介绍DESeq2 的分析流程

载入数据及生成DESeqDataSet

由于mobData 中的行名没有提供基因的ID，我们也不是为了探究生物学问题，就以mobData 的行数作为其ID

library(DESeq2)
library(dplyr)
load("data/mobData.RData")
head(mobData)
##      SL236 SL260 SL237 SL238 SL239 SL240
## [1,]    21    52     4     4    86    68
## [2,]    18    21     1     5     1     1
## [3,]     1     2     2     3     0     0
## [4,]    68    87   270   184   396   368
## [5,]    68    87   270   183   396   368
## [6,]     1     0     6    10     6    12
dim(mobData)
## 3000    6

row.names(mobData) <- as.character(c(1:dim(mobData)[1]))
mobGroups <- c("MM", "MM", "WM", "WM", "WW", "WW")
colData <- data.frame(row.names=colnames(mobData),
                      group_list=mobGroups)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = mobData,
                              colData = colData,
                              design = ~group_list,
                              tidy = F)
dds
## class: DESeqDataSet 
## dim: 3000 6 
## metadata(1): version
## assays(1): counts
## rownames(3000): 1 2 ... 2999 3000
## rowData names(0):
## colnames(6): SL236 SL260 ... SL239 SL240
## colData names(1): group_list

DESeqDataSet 是DESeq2流程中储存read counts和中间统计分析数据的对象，之后的分析都建立在该对象之上进行。

DESeqDataSet 可以通过以下四种方法产生：

From transcript abundance files and tximport —— DESeqDataSetFromTximport

From a count matrix —— DESeqDataSetFromMatrix

From htseq-count files —— DESeqDataSetFromHTseqCount

From a SummarizedExperiment object —— DESeqDataSet

预处理

在进行差异分析之前，需要对样本数据的表达矩阵进行预处理，包括：

去除低表达量基因
探索样本分组信息 -- 有助于挖掘潜在的差异样本

table(rowSums(counts(dds)==0))
## 
##    0    1    2    3    4    5    6 
## 1833  442  324  170   92   84   55
keep <- rowSums(counts(dds)==0) < 6
dds.keep <- dds[keep, ]
dim(dds.keep)
## [1] 2945    6

library(factoextra)
library(FactoMineR)
count.pca <- counts(dds.keep) %>% as.matrix %>% t %>% PCA(.,graph = F)
fviz_pca_ind(count.pca,
             col.ind = mobGroups, 
             addEllipses = F, 
             mean.point = F,
             legend.title = "Groups")

colnames(dds.keep) <- c(paste(colnames(dds.keep),mobGroups, sep =".")) 
counts(dds.keep) %>% as.matrix %>% t %>% dist %>% hclust %>% plot
colnames(dds.keep) <- colnames(dds)

通过PCA结果来看各组样本分组情况还是不错的，但hclust的聚类结果反映的分组就略微有点混杂了，可能要聚类计算的距离函数选用不当有关。

差异分析

使用DESeq()函数进行差异分析时，该函数干了以下三件事：

计算文库大小，预测用于标准化的size factor
预测离散度（dispersions）
使用负二项分布的广义线性回归模型（GLM）进行拟合，以及进行Wald test

The Wald test (also called the Wald Chi-Squared Test) is a way to find out if explanatory variables in a model are significant.

ref : https://www.statisticshowto.com/wald-test/

degobj <- DESeq(dds.keep);degobj
## class: DESeqDataSet 
## dim: 2945 6 
## metadata(1): version
## assays(4): counts mu H cooks
## rownames(2945): 1 2 ... 2999 3000
## rowData names(26): baseMean baseVar ... deviance maxCooks
## colnames(6): SL236 SL260 ... SL239 SL240
## colData names(2): group_list sizeFactor
countdds <- counts(degobj, normalized = T)
deg.res1 <- results(degobj, contrast=c("group_list","MM","WW"), pAdjustMethod = 'fdr')

counts() 可以提取DESeq object中的表达矩阵，而results() 可以提取差异分析的结果，其中包括了：

样本间的均值, log2 fold changes, standard errors, test statistics, p-values and adjusted p-values.

使用results()函数时需要指明进行比较的样本，这里用 contrast=c("group_list","MM","WW") 提取MM组和WW组进行差异分析的结果。如果想要比较WM组和WW组，只要改变contrast=c("group_list","WM","WW") 即可。

# result default
results(object, contrast, name, lfcThreshold = 0,
    altHypothesis = c("greaterAbs", "lessAbs", "greater", "less"),
    listValues = c(1, -1), cooksCutoff, independentFiltering = TRUE,
    alpha = 0.1, filter, theta, pAdjustMethod = "BH", filterFun,
    format = c("DataFrame", "GRanges", "GRangesList"), test,
    addMLE = FALSE, tidy = FALSE, parallel = FALSE,
    BPPARAM = bpparam(), minmu = 0.5)

检查结果中是否包含NA值

dim(deg.res1)
## [1] 2945    6
apply(deg.res1,2, function(x) sum(is.na(x)))
##       baseMean log2FoldChange          lfcSE           stat         pvalue 
##              0              0              0              0              0 
##           padj 
##           1142

这里padj中有1142个NA值是因为使用results()提取差异分析结果时，大于alpha值（这里是0.1）的矫正后p-value都会被当做是NA。因此，我们将这些padj值都设为1

deg.res1$padj[is.na(deg.res1$padj)] <- 1
table(is.na(deg.res1$padj))
## 
## FALSE 
##  2945
summary(deg.res1)
## 
## out of 2945 with nonzero total read count
## adjusted p-value < 0.1
## LFC > 0 (up)       : 102, 3.5%
## LFC < 0 (down)     : 215, 7.3%
## outliers [1]       : 0, 0%
## low counts [2]     : 0, 0%
## (mean count < 4)
## [1] see 'cooksCutoff' argument of ?results
## [2] see 'independentFiltering' argument of ?results
plotMA(deg.res1)

使用MA-plot查看fold change与read counts的关系

排序后以log2FoldChange绝对值大于1， padj小于0.05为条件筛选显著的差异表达基因

deg.ord1 <- deg.res1[order(deg.res1$padj, decreasing = F),]
deg.sig1 <- subset(deg.ord1,abs(deg.ord1$log2FoldChange)>1 & deg.ord1$padj<0.05)
deg.sig1
## log2 fold change (MLE): group_list MM vs WW 
## Wald test p-value: group_list MM vs WW 
## DataFrame with 217 rows and 6 columns
##              baseMean    log2FoldChange             lfcSE              stat
##                                        
## 2500 159.774533763595 -4.11069945121082 0.432943287486228 -9.49477580557611
## 1212 112.711030407211  3.96456274705605 0.449008108800994  8.82960166942819
## 1917  303.58162963147  3.45479344900962 0.406885893259752  8.49081648255649
## 490   71.687159921068 -6.18926587678444 0.753506435554632 -8.21395224345857
## 1317 222.718984861955 -3.03292643435534  0.37190983516799 -8.15500464779421
## ...               ...               ...               ...               ...
## 1792 5.98829479907705 -4.93244157414254  1.77616534224116 -2.77701712607386
## 98   6699.69196582045  1.19245883058489 0.429894831042278   2.7738384936934
## 295  6699.58197403621  1.19259109051591 0.429948214187822  2.77380170718637
## 662  5.15806783175131 -5.09298667756621  1.83903942690847 -2.76937329512713
## 899  18.1185589826749 -3.43948745771197  1.24400277511213 -2.76485513257955
##                    pvalue                 padj
##                             
## 2500 2.20685744092375e-21 3.97896396598552e-18
## 1212 1.05049159823894e-18 9.47018175812401e-16
## 1917 2.05190369014182e-17 1.23319411777524e-14
## 490  2.14024730609951e-16 9.64716473224354e-14
## 1317  3.4916644951535e-16 1.25909421695235e-13
## ...                   ...                  ...
## 1792  0.00548602882496584    0.046221074632773
## 98    0.00553991737467495   0.0462481504691228
## 295    0.0055405438166004   0.0462481504691228
## 662   0.00561642447454876   0.0466654992055826
## 899   0.00569480805304419   0.0468846526010898

至此，便筛选出了217个在MM组和WW组之间的显著差异表达基因。至于后续的可视化分析则是因课题而异了，等以后有空了再补坑吧！

有同学可能注意到，虽然我们的样本有多个组，但在差异分析时进行的还是pairwise的分析，为什么我们不可以三个组一起分析呢？学过ANOVA的同学应该都知道，ANOVA就是可以应对这种多组差异分析的情况。但要注意的是，ANOVA只可以告诉我们对于某个基因在这三组中是否存在差异，想要找出是哪一组有其他组别有差异还是需要进行pairwise t-test之类的分析。所以，在这里我们两组两组地进行分析正是出于这个考虑，并且有更方便我们解释差异分析的结果，说明在A组基因的表达量相对于B组的是上调还是下调。另外，本文的差异分析还是处于单因子水平（只有一个变量），至于多因子的差异分析以后研究透了再和大家进行分享。

一点想法：

最近想要整理这些转录组常规分析流程，一来是因为之前学习的时候很零碎，想借此机会系统性地整理这方面的知识。另一方面也是因为我感觉平时做湿实验的时候都讲究个protocol，一些基本的实验，像PCR这种我们只要根据具体实验调整一些参数就都可以跟着protocol来做了。所以，一些经典的生信分析也可以有一个这样的“protocol”，要用的时候调整参数就可以了。

参考文章：

https://web.stanford.edu/class/bios221/labs/rnaseq/lab_4_rnaseq.html

https://www.researchgate.net/post/How_to_interpret_results_of_DESeq2_with_more_than_two_experimental_groups

https://bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/DESeq2/inst/doc/DESeq2.html#htseq

https://bioconductor.org/packages/release/bioc/manuals/DESeq2/man/DESeq2.pdf

完。

简单的转录组差异基因表达分析 -- DESeq2

载入数据及生成DESeqDataSet

预处理

差异分析

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