腺相关病毒（AAV）用于基因治疗

1. 腺相关病毒（AAV）背景

腺相关病毒（AAV）是单链DNA病毒，基因组结构简单，全长约4.7kb。在多种脊椎动物物种中被发现，包括人类和非人类灵长类动物（NHPs）。是微小病毒科家族的成员之一，其增殖复制需要腺病毒（如Ad）或单纯孢疹病毒（HSV）的辅助。在缺乏辅助病毒的情况下，AAV可以在许多类型的细胞中长期潜伏存在。目前的共识是，AAV不会引起任何人类疾病。
重组腺相关病毒（rAAV）： 是利用AAV2型基因组与不同血清型衣壳蛋白基因组结合产生的混合病毒载体。（通常我们所说的AAV其实是rAAV）

如今，重组AAVs（rAAVs）是基因治疗体内传递的领先平台，目前有四款AAV基因药物上市：Glybera（2012年，脂蛋白酯酶缺乏症），Luxturna（2017年，遗传性视网膜疾病），Zolgensma（2019年，脊髓性肌萎缩症），Upstaza（2022年7月，AADC缺乏症）

2. AAV开发史

• 1965-1966年相继报道AAV的发现
• 1982-1983年完成AAV2的基因克隆和基因组测序
• 1984年 AAV开始被用于体外基因传递，同时80年代末高质量的重组AAV（rAAV）的开发极大得促进了rAAV作为基因传递载体的使用
• 1993年 rAAV第一次用于动物体内基因传递，1994年工艺优化后被报道用于哺乳动物体内持续基因的表达
• 1995年 AAV载体首次用于人类疾病治疗（囊性纤维化疾病）
• 2002-2004，更多的AAV血清型（也就是衣壳蛋白类型）被报道，可以感染更多种类的细胞-->增加可感染谱，极大得扩展了体内基因传递的AAV工具箱
• 2008年 AAV基因治疗产品在Leber先天性黑蒙的治疗试验中得到了令人信服的结果
• 2012年 第一个基于AAV的基因治疗药物Glybera获得了EMA的批准
• 2017年 Luxturna成为FDA第一个批准的AAV基因治疗产品

图1. 腺相关病毒（AAV）在基因治疗中的里程碑事件

2. AAV感染机制

AAV感染机制如图2A，分为一下几个步骤：

• （1）病毒识别：腺相关病毒（AAV）的衣壳蛋白被宿主的糖基化细胞表面受体识别（不同的 衣壳类型决定它能被哪类细胞识别）
• （2）病毒内化：通过内吞作用触发病毒的内化并形成内体，通过细胞质内的骨架网络进行运输
• （3）病毒逸出：受细胞质内PH环境的变化，内体产生孔洞造成病毒逸出
• （4）病毒进入细胞核：部分病毒进入细胞核，但并不是所有的AAV都能进入细胞核，也会有部分被蛋白酶体降解成多肽（多肽可以被MHC递呈供T细胞识别，因此高剂量也会造成免疫毒性）
• （5）病毒脱壳：进入细胞核的病毒释放出裸漏的遗传物质，目前有两种rAAV在使用：单链的AAV（ssAAV）和自互补的AAV（scAAV）

单链的AAV：单链的AAV（ssAAV）被包装为正链基因组或负链基因组，这些单链形式在到达细胞核时仍然转录惰性，必须转化为双链DNA是转录的先决条件。这种转化可以通过宿主细胞DNA聚合酶的第二链合成（如图2A Second strand synthesis所示）或通过在细胞核中可能共存的正负链的链退火来实现（如图2A Strand annealing所示）。
自互补的AAV：自互补的AAV（scAAV）为双链DNA结构，可以省去ssAAV所需要的“双链转化”步骤，因而进入细胞核脱壳后能被立即转录。

• （6）scAAV成环：rAAV基因组中存在的病毒倒置末端重复序列（ITRs）可以驱动分子间或分子内重组，形成环状的外泌体基因组，以此形式作为染色体外游离体长期存在。不过，载体基因组也可以以非常低的频率整合到宿主基因组中。

图2.腺相关病毒感染机制与结构示意图； 图A. rAAV转导通路图; 图B.AAV结构图；图C.rAAV改造图

3. AAV基因组结构与血清学亚型

未改造的AAV是单链DNA病毒，基因组结构简单，全长约4.7kb（作为载体时，插入目标基因长度控制在2.8kb左右）。整体可以分为以下3个区域（如图2B）：

• （1）ITR区：AAV基因组DNA的两端为145个核苷酸长度的 反向末端重复序列（Inverted terminal repeat, ITR），ITR序列折叠成发卡结构，是DNA复制起始和包装重组AAV基因组为感染性的病毒颗粒所需的顺式作用元件。
• （2）Rep基因区： Rep基因编码Rep78、Rep68、Rep52、Rep40四种蛋白质，主要作用于 病毒基因组复制 以及与 宿主基因组的整合。
• （3）Cap基因区： Cap基因编码VP1、VP2和VP3三种病毒衣壳蛋白和组装激活蛋白AAP，主要作用于 病毒基因组的包装 以及 从宿主细胞中的分泌。（现在发现的十多种常见血清以及上百种病毒变种的主要区别在于衣壳蛋白Cap基因的不同，编码结构蛋白的不同会导致不同血清型的AAV对不同组织和细胞感染效率不同）

VP1和VP2蛋白共享VP3序列，并在其N端具有其他残基。

• VP1：其N端有一个保守的磷脂酶A2序列，该序列与病毒从体内逃逸有关，并对其感染性至关重要
• VP2：该蛋白对于组装或者感染并非必不可少
• VP3：该蛋白的核心由保守的β-桶基序组成，决定了不同血清型AAV与宿主细胞作用受体的差异

4. AAV相关临床实验进展

rAAV适用于作为缺陷型遗传病的基因修复载体，不同的血清型所靶向的组织类型也是不同的。

• AAV2：是人类发现最早、研究最早的血清型，但其有一定局限性；
• AAV5：动物体内大多存在AAV的抗体（曾被感染，却不致病），但目前在人体中，AAV5血清型抗体存在的概率最小
• AAV9：从人的肝组织中分离得到，显示出穿越血脑屏障的能力，使得其成为中枢神经系统疾病（CNS）转运载体的主要衣壳

从图3中可以得到目前临床试验中的rAAV载体药物仍然以AAV2为主，靶向器官也局限于眼、肝脏、肌肉，临床试验都处在较早的临床I期和II期。

图3. rAAV作为基因治疗载体临床实验汇总图：图a. 145个已注册的临床试验根据血清型分类；图b. 145个已注册的临床试验根据靶向器官分类；图c.145个已注册的临床试验的阶段进展分类；数据集来源于https://www.clinicaltrials.gov/（2018/11/3）

流行病学分析现实，40%-80%的人群中AAV抗体阳性，这表明人类来源的衣壳可能会因为预先存在的AAV衣壳免疫而降低转导效果。同时，AAV1、AAV2、AAV3、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9是人类特有的。非人类来源分离的衣壳才有可能克服先前存在的免疫。迄今为止，从非人类的灵长类动物（NHP）中分离的衣壳显示出巨大的应用前景。

选择合适的衣壳作为基因药物载体至关重要，目前的 衣壳设计筛选方法：

方法	优点	缺点	特点
天然发现	可靠性强	筛选难度大，有可能存在免疫抗体	类似于挖矿
定向进化	定向选择，针对性强	技术门槛高，周期长，成本高	通过自然选择的方法（需要基数大才更有效）
理性设计	成本低	成功率低	赌小概率事件
AI辅助的定向进化	高通量，成本低，周期短	技术门槛高	高价培养特种兵

5. AAV制备工艺

根据 包装系统 不同，目前应用较多的为 三质粒转染体系 和 杆状病毒-SF9系统，以下为两种方式的对比表：

包装系统	优势	技术上的劣势	商业上的劣势
三质粒转染体系	无辅助病毒污染；生产周期短；可放大悬浮系统；无/低 许可费用	工艺相对容易；空壳率高；低产率	工艺放大成本高
杆状病毒-SF9系统	可放大悬浮系统；无血清培养	Baculovirus污染；交货周期长；纯化分析要求高	细胞系许可费用高；投资成本大；临床生产时间长

5.1 三质粒转染体系-HEK293

将以下3种质粒导入工程细胞HEK293，各元件表达并组装rAAV（有可能存在空壳病毒，后续需要纯化剔除）

• （1）辅助质粒（Adenovirus-derived helper plasmid）：含有腺病毒的重要元件，参与病毒颗粒增殖
• （2）包装质粒（Plasmid containing two essential AAV genes）：包含Cap（编码病毒衣壳蛋白）和Rep（参与病毒的复制）基因
• （3）表达质粒（Gene therapy sequence）：即包含需表达目的基因以及两个末端ITR

三质粒转染体系-HEK293示意图

5.2 杆状病毒-SF9

利用杆状病毒表达载体（Baculovirus expression vectors, BEVs）感染SF9昆虫细胞来生产rAAV病毒颗粒。借助SF9细胞可以大量表达重组蛋白的特点，该系统使用含有rAAV基因组以及AAV-Rep、AAV-Cap基因的昆虫杆状病毒转导SF9细胞，使rAAV在SF9细胞中组装，最终达到大规模生产rAAV的目的。

• 将rep/cap基因稳定地整合到SF9细胞系基因组，并受一个启动子/增强子控制
• 杆状病毒感染可诱导该启动子/增强子

由于SF9昆虫细胞可以在大规模反应器中高密度悬浮培养，因此该系统更容易放大规模；同时，杆状病毒对于哺乳动物和植物是非致病性的，且采用无血清培养体系，相较依赖质粒转染的293细胞生产系统更为安全。2012年，欧洲药品管理局（EMA）批准的首个rAAV基因治疗药物Glybera正是利用SF9昆虫细胞生产系统生产的rAAV病毒颗粒。

6. 参考链接

AAV背景介绍：Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery
三质粒制备系统：TRIPLING DOWN ON EFFICIENT GENE THERAPY PRODUCTION