Illumina测序原理

illumina二代测序平台特点：基于可逆终止的、荧光标记dNTP，实现边合成、边测序的工作
文字描述着实有很多局限性，文章起草基于这份视频（双端index），想要更轻松的阅读体验建议配合视频一起看：http://www.bilibili.com/video/av13107081/?share_source=copy_link&p=1&ts=1610448077&share_medium=iphone&bbid=a68e072c29d899785ac6735b234b9654](http://www.bilibili.com/video/av13107081/?share_source=copy_link&p=1&ts=1610448077&share_medium=iphone&bbid=a68e072c29d899785ac6735b234b9654)
注意⚠️：文章内容纯属个人见解，如有错误欢迎批评指正～

1. 文库制备

DNA文库的定义：所谓的DNA文库，实际上是许多个DNA片段，在两头接上了特定的DNA接头。

DNA文库的特点：

• 中间插入的DNA片段：是未知的各式各样的DNA片段，也正是测序仪要检测的序列片段
• 接头序列：是人工特地加上去的，其序列是已知的

如何制作DNA文库：

文库制备过程

基因组DNA用超声波打断（也可以用通过酶切的方法）获得短的DNA片段，其粘性末端使用T4-DNA聚合酶补成平末端，然后用klenow酶在3'端加上polyA碱基（方便接头嫁接到DNA片段），最后，连接酶将特定的接头连接上去。连接好接头的DNA片段混合物，我们称为文库。

加入接头

2. 成簇反应

了解flowcell
flowcell（流动池）为一个载玻片大小的芯片，里面做了8条通道，通道的内表面做了专门的化学修饰：主要是用2种寡核苷酸（oligo）通过“共价键”种在玻璃表面-在flowcell通道有液体流动时不会轻易冲掉，这2种寡核苷酸（oligo）后面会和测序DNA文库的接头序列相互互补。

flowcell

1）文库片段附着到“flowcell上的oligo”
DNA文库两头的序列和芯片上的引物碱基互补，因此可以通过氢键力互补杂交。待测序的DNA片段通过氢键力与第一种oligo配对从而固定在flowcell上。
2）被文库片段附着的oligo延伸出互补的DNA链
加入DNA聚合酶和dNTP，flowcell上的oligo做引物，以文库片段为模版，合成出一条全新的DNA链（和原来的文库片段序列完全互补）
3）冲走文库片段
加入NaOH碱溶液，破坏氢键力，模版链（文库片段）被冲走，只剩下与芯片通过共价键连接的DNA链
4）通过“桥式PCR”将序列信息复制到第2种oligo
加入中性液体，中和碱液，创造可以产生氢键力的环境。
此时，第一种oligo所在DNA链上的自由端，会通过成桥的方式和flowcell上的第二种oligo互补配对（形成“单链桥”）。我们加入聚合酶和dNTP，聚合酶就沿着第二个oligo合成出一条新的链来（形成“双链桥”）。
5）DNA链线性化
加入NaOH碱溶液，破坏氢键力，“双链桥”解开（两个单链被固定在flowcell）
6）重复“桥式PCR”
再加入中性液体，中和碱液。DNA链的游离末端又和flowcel上新的oligo成桥，再加酶和dNTP，在尚未被占用的oligo上合成新的DNA链。
连续重复以上过程，DNA链的数量以指数方式增长
7）形成测序链
多次桥式PCR完成之后，实现了DNA文库序列在flowcell上的成倍扩增（实则是为了放大测序阶段的荧光信号）
后面要把合成的双链，变成可以测序的单链
方法：把反义链上的特定基团切断，即断开了反义链与oligo的连接，然后用碱溶液冲洗，被切断了的DNA链被冲掉，只留下通过共价键连接的正义链。
同时，DNA链的3'端被封锁，以防止与oligo的非特异结合。

3. 测序阶段

了解 可逆终止、荧光标记的dNTP：

1. 荧光标记的dNTP：不同碱基的识别信号（4种dNTP，每一种上面标的荧光素都不一样）

2. 阻断基团：通过控制 3'羟基，控制碱基的合成节奏

   
   
   特殊的dNTP

1）read1读取
溶液状态：加入中性溶液，使其适应测序阶段。
所需原料：加入read1测序引物，荧光标记的dNTP，DNA聚合酶
测序过程：

• 合成一个碱基：根据碱基互补的原理，DNA聚合酶将正确的dNTP合成到新的链上，合成一个碱基后即停止
• 激光扫描：用溶液把多余的dNTP和酶冲掉，然后激光扫描，根据发出来的荧光判断它是那个碱基，根据碱基互补的原则，反推模版链上的碱基
• 切掉荧光基团和阻断基团：加入化学试剂，把叠氮碱基和旁边标记的荧光基团切掉（暴露出3'羟基）
• 加入新的dNTP和酶：又延长一个碱基，把多余的酶和dNTP冲掉，激光扫描判断碱基类型
• 重复以上过程，把上百个碱基读出来（循环的次数取决于读长）
• read1读完之后，读段产物会被碱液冲洗掉

2）读 index1 序列
因为测序仪的测序通量很大，一个样本用不到几百万条DNA，因此常常多个样本的DNA文库混在一起在同一条lane测序。而每一个样本，都有一个特定的索引序列相互区分（也就是我们常说的index序列）。

• 加入index1引物，与模版碱基互补杂交
• 与reads1的判读过程类似，加入荧光标记的dNTP和DNA聚合酶判读碱基，读完后用碱液冲洗掉

3）读 index2 序列

• 3'端解除封锁
• 正义链折叠结合到flowcell上的第2个oligo（形成“单链桥”）
• 加入荧光标记的dNTP和DNA聚合酶，读取index2

4）读read2序列
形成反义链：
index2读完之后，聚合酶继续延伸，形成双链桥
然后加入碱液将DNA双链线性化
正义链上的特定基团被切除并洗掉，只留下反义链

加入read2的测序引物，与reads1的读取一样，重复测序步骤

4. 数据分析

测序获得的数百万个读段序列都通过 index序列 分离归类到对应的样本。

具有相似延伸碱基的reads被聚类在一起，正向和反向reads配对形成连续序列，它们与参考基因组比对，用于突变识别（variant identification）

突变类型的判读