Nature Cell Biology项目文章 | 通过单细胞测序分析儿童B细胞急性淋巴细胞白血病微小残留病

2月10日，中国医学科学院血液学研究所竺晓凡、程涛团队与清华大学古槿团队在Nature Cell Biology上发表了题为“Elucidating minimal residual disease of paediatric B-cell acute lymphoblastic leukaemia by single-cell analysis”的学术论文。本文通过单细胞转录组及单细胞VDJ测序实现了对B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)在诊断、治疗和复发时的动态变化分析，发现了抑制缺氧途径使白血病细胞对化疗敏感，为B-ALL的有效治疗指明了道路。诺禾致源为该研究提供了单细胞建库测序分析服务。

研究思路

结果

构建正常B细胞的分化路径

作者对健康骨髓单个核细胞样本进行单细胞转录组分析，定义出不同B细胞分化阶段的细胞群，同时对BCRs进行测序研究发现BCR的表达没有出现克隆扩增现象。根据不同细胞群差异高表达的marker gene以及拟时序分析，构建了典型的B细胞分化轨迹，确定了从多能祖细胞(HSC/LMPP)向活化的B细胞的分化。对细胞周期进行分析显示，preBII、未成熟B细胞、成熟B细胞及活化B细胞群中，处于S期的细胞占比少于5%。随后作者评估了B细胞分化过程中关键转录因子的表达谱，构建了不同发育阶段细胞的特异性基因之间的关系网络

利用单细胞转录组+VDJ测序技术对白血病细胞进行分类

对4例B-ALL患者骨髓单个核细胞样本进行单细胞转录组及VDJ测序分析，包括诊断-治疗（D19）-复发三个时期，在D19阶段的MRD细胞中，根据BCR克隆多样性，作者判定不表达肿瘤特异性MLL ENL融合基因、且BCR非克隆表达的CD19+CD20+ B细胞是非白血病细胞。随后作者构建了一种机器学习方法，根据全基因组表达模式区分白血病细胞和非白血病细胞，并利用健康供体细胞、诊断阶段白血病细胞和复发阶段白血病细胞，通过BCR表达进行区分测验，最终证实该分类器具有良好的性能。

诊断阶段和复发阶段白血病细胞的比较

作者通过构建的分类器对4例复发患者的白血病细胞进行鉴定，并确定了白血病细胞的分化阶段、细胞周期。对患者的698个差异基因进行癌症标志分析，发现复发阶段的细胞，活性氧途径、各种MYC靶点等显著上调，其中CDKN1A（细胞周期调控蛋白P21）是复发期最常见的上调基因之一。随后作者在体外实验中，证实了敲除CDKN1A基因可使B-ALL细胞对化疗药物DNR、AraC敏感，P21抑制剂与化疗药物联用，起到有效协同作用，使B-ALL细胞凋亡显著增加。

残留细胞中缺氧途径被激活

作者进行差异基因通路富集分析，发现与诊断阶段、复发阶段的细胞相比，D19治疗阶段的细胞缺氧通路的相关基因在化疗期间显著上调，四位病人中的三位缺氧通路显著富集。为了探讨生理环境下缺氧通路的功能激活，作者建立了B-ALL PDX小鼠MRD模型，应用化疗药物AraC治疗后，缺氧信号通路关键调控蛋白HIF1α及通路下游基因表达量增加；应用化疗药物AraC与HIF1α抑制剂PX478联合治疗后，患病小鼠寿命显著延长，说明化疗后残留细胞中的缺氧途径可能是B-ALL患者的普遍治疗靶点。

总结

作者在单细胞分辨率下对B-ALL细胞进行识别，并纵向分析了诊断阶段、治疗阶段到复发阶段的残余细胞分化，发现了缺氧信号通路这一有价值的治疗MRD的靶点，深入了解了MRD细胞的转录组特征，为其他血液系统恶性肿瘤和实体癌症的治疗提供了研究思路。