文献阅读--植物精卵融合过程粘附因子GEX2的发现

本次精读的是一篇老文章，2016年发表在《current biology》上的《Gamete Attachment Requires GEX2 for Successful Fertilization in Arabidopsis》，通讯作者是新加坡国立大学生物科学系的Frederic Berger教授（我猜是图片中间那个）。研究兴趣翻译如下：保守的蛋白质组蛋白不仅仅是DNA的简单支架，还参与基因组活动的调节。 我们探索核心组蛋白的变体如何影响基因组表达，组织和遗传。 我们还研究了组蛋白变体与其他染色质修饰之间的相互作用，从而贡献了表观遗传，从而调节了体细胞和生殖组织中的细胞事件。 应该是做生殖中表观的大佬，不知道为什么做了这篇文章。

通讯作者

科学问题：植物双受精过程是否需要主动配子识别和附着机制（就是想做配子融合）。

背景：对植物双受精过程知之甚少，只有参与融合的HAP2以及精细胞激活的EC1

怎么办，正向遗传学来帮忙！（正向遗传学对于一个未知或是知之甚少的领域是一个很好的办法，但是缺陷是对于冗余性较高的基因是个问题，如果像DMP9倒也还行，要知道拟南芥60%以上的基因都发生过复制事件）

怎么做：双 marker (DM) line, HTR10-RFP (snRFP）精细胞核 DFWA-GFP(ccGFP)  中央细胞 标记

0.3%  EMS 处理 8h，5000棵M1种下，筛选育性缺陷的材料，发现一个材料Y47，受精过程中发现未受精的精细胞，并且苯胺蓝染色显示花粉管接收的过程没有问题，注意此时精细胞应该没有分开。并且通过延时摄影技术发现精细胞到中央细胞后长时间不动，两个实验确定下来是融合过程起作用。回交实验确定是雄方的问题。

受精未融合

WT

gex2突变体

有表型就好办，就是定位基因吧，定位到271Kb时候，发现一个强精细胞定位的基因GEX2，测序发现是个点突G变成A。Y47命名为gex2-1 ，为了确定表型，作者要来T-DNA插入突变体gex2-2 发现一个表型。此外在做个回补实验，好了，基因确定的表型做完了。

确定突变类型

回补实验

下面就对这个基因的特征就行分析被，先看结构：单次跨膜，有信号肽，有lg-like区域这一点和哺乳动物中izumo类似，这个胞外域超级长。接GFP发现定位在精细胞膜上。

GEX2结构

亚细胞定位

再次仔细观察表型，发现除了没有发育的胚珠，在突变体自交的植物中还发现了中止发育的种子，于是找回去，发现是存在单次受精事件，又做了回补，确定还是GEX2的问题，这里就比较绕，表型和回补一会说不好吗？

左：正常 中：胚乳正常 右：胚胎正常】

那么GEX2到底参与精卵融合过程的那一部分呢？于是他们找到了卵细胞的Marker：emGFP(pDD45::GFP-PIP2a  and enRFP，观察，他们先用消化酶处理细胞壁，发现卵细胞和中央细胞变成圆形，说明细胞壁处理好了。相比于HAP2能够粘附在卵细胞和中央细胞上，gex2则有的一个粘附在卵细胞上，一个没有粘附，或者根本没有粘附。结合统计为粘附的比例远远大于已知参与融合过程hap2，还有延迟成像过程中，精细胞一致在粘附和去粘附，认为GEX2参与粘附的过程。

gex2的粘附

统计

作者最后做了一个演化上的问题：计算Ka/Ks 选择压，用A. thaliana A. lyrata，发现相比于HAP2（这个多保守），GEX2快速演化，且主要是lg-like的区域（猜猜也知道）。

评论：我觉得后期统计粘附还不够精细，既然你发现存在单次受精事件，那到底是谁的单次受精不知道，那么统计粘附是完全可以把单次粘附的数据加上，看看到底什么样子，而且整体来说n值有点小。并且整体来看GEX2调控的去粘附比例也就40%左右，可能存在冗余基因。但是毫无疑问，作者是极为幸运的，5000棵苗就筛到了基因，但是接下来又存在很多问题，还有没有其他基因参与粘附，其在卵细胞上的识别蛋白又是什么？这还有待进一步发现。