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研究背景
线粒体在细胞、组织和器官的能量代谢和凋亡中起着至关重要的作用。并且线粒体是细胞内活性氧(ROS)的主要来源，与多种生理过程有关。然而，过量的ROS可诱导线粒体氧化损伤，最终导致包括神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、癌症在内的许多病理情况。
为了保护细胞免受氧化损伤，线粒体同时拥有大量的自由基清除剂和线粒体硫醇，包括同型半胱氨酸(Hcy)、半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)，它们通过游离硫醇和氧化二硫化物的平衡与生物系统中的抗氧化过程密切相关，从而在复杂的生理和病理过程中发挥重要作用。
正常细胞内同型半胱氨酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的浓度分别约为5-12μM、30-200μM和1-10 mM。细胞内硫醇浓度的大幅波动会导致许多疾病。谷胱甘肽(GSH)是细胞内含量最丰富的生物硫醇，通过保护细胞免受活性氧(ROS)和自由基的伤害，维持氧化还原动态平衡，这对正常的细胞功能非常重要。偏离正常浓度的谷胱甘肽浓度可能会导致癌症等严重疾病。
研究表明，上述三种硫醇是相互关联的，这些硫醇水平的显著降低会导致线粒体损伤和功能障碍。为了更深入地了解各种相关疾病的生理机制和诊断，探索实时监测活细胞线粒体硫醇波动的方法至关重要。
由于硫醇基团的高反应性，各种荧光探针已被开发出来，它们采用不同的机理，如Michael加成反应、二硫键交换反应、与醛的环化反应、亲核取代反应等，用于生物硫醇的检测。
本文的工作
图 1
作者设计并合成了一种新的线粒体靶向探针Cy-DNBS，即DNBS修饰的菁，用于体外和活细胞中的选择性巯基检测和成像(图 1)。该探针以亲脂性阳离子单元为线粒体靶点，DNBS基团为荧光猝灭剂和识别位点。由于荧光团和DNBS基团之间的光致电子转移(PET)，CY-DNBS在没有硫醇的情况下没有荧光。
加入硫醇后，由于DNBS基团的去除和PET过程的阻塞，在604 nm处可以检测到明显的荧光发射。作者研究了该探针在水溶液中的光谱响应，以及在活细胞中的光谱响应。结果表明，该传感器对硫醇具有较高的灵敏度和选择性，并具有良好的线粒体靶向能力。
(1)Hela细胞的共定位成像
图 2
为了确认Cy-DNBS的亚细胞分布，使用商用线粒体特异性荧光染料MitoTracker®Green
FM进行了荧光共定位实验。如图2所示，红色通道中Cy-DNBS对硫醇的响应荧光与MitoTracker®Green
FM的荧光完全重叠，皮尔逊相关系数高达0.91。相比之下，红色通道中探针的荧光与市售蓝荧光细胞核染料Hoest
33342的荧光重叠性较差，皮尔逊相关系数为0.26。这些结果有力地表明Cy-DNBS具有很好的靶向活细胞线粒体的能力。
(2)HeLa细胞内源性生物硫醇的Cy-DNB的共聚焦荧光图像
图 3
如图3所示，单独的HeLa细胞没有显示荧光。在37℃培养30分钟的Cy-DNBs(5 μm)后，由于Cy-OH的形成，细胞显示出明显的红色荧光。结果表明，Cy-DNB可以有效地渗透到细胞中并与硫醇反应以产生荧光。然而，当用500 μM N-苯基甲基酰亚胺（NMM，硫醇清除剂）预处理细胞30分钟，然后与Cy-DNBS(5 μm)孵育30分钟，观察到荧光，表示Cy-DNB的荧光性能确实归因于硫醇相互作用。这些结果证实，Cy-DNB可以用作各种癌细胞中的生物成像的强大工具。
(3)Hela细胞中Cy-DNB的共聚焦荧光图像
图4
许多证据表明线粒体维持细胞氧化还原性稳态，细胞内硫醇水平与线粒体氧化应激相关。为了评估探针Cy-DNB是否可以检测活细胞中氧化应激引起的硫醇水平的波动，作者使用Cy-DNB在用H2O2刺激的活的HeLa细胞中对硫醇进行图像硫醇。如图4所示，与未经H2O2处理的细胞相比，用H2O2(1mM)预处理30分钟的HeLa细胞显示出明显的降低减少荧光发射。这些结果表明，降低的硫醇浓度是由H2O2消耗或氧化引起的。因此，Cy-DNB可用作监测氧化应激诱导的细胞内硫醇波动的强大探针。
文献原文：Zhu, Y.; Pan, H.; Song, Y.; Jing, C.; Gan, J.-A.; Zhang, J., Mitochondria-targeted fluorescent probe for rapid detection of thiols and its application in bioimaging. Dyes and Pigments 2021, 191.
DOI:10.1016/j.dyepig.2021.109376