LINC00467, Driven by Copy Number Amplification and DNA Demethylation, Is Associated with Oxidative Lipid Metabolism and Immune Infiltration in Breast Cancer
由拷贝数扩增和DNA去甲基化驱动的LINC00467与乳腺癌的氧化脂质代谢和免疫浸润有关
发表期刊：Oxid Med Cell Longev
发表日期： 2021 Dec 15
doi:10.1155/2021/4586319
一、背景
乳腺癌（BRCA）是影响全世界妇女的最常见的恶性肿瘤之一，每年大约有超过130万的妇女在其一生中会患上BRCA。BRCA主要可分为腔内A型、腔内B型、正常乳腺型、HER-2型、基底型等亚型。BRCA的病因很复杂，其中肥胖和吸烟是最常见的危险因素，然而由于乳腺癌的瘤内异质性，其发病机制仍不清楚。此外，BRCA复发和转移的预测性生物标志物仍然不可用。BRCA的肺，肝，骨和脑远端转移已被确定为最常见和最麻烦的后果;因此，寻找BRCA的新治疗靶点和分子生物标志物具有重要意义。
LncRNA是一种长度超过200个核苷酸的非编码RNA（ncRNA）分子。它可以在表观遗传、转录、翻译和翻译后水平上调节基因表达。研究表明，研究表明，lncRNA表达不良，并参与各种癌症（包括BRCA）的病理过程。lncRNA在BRCA中起着至关重要的作用，但其机制尚不清楚。此外，临床实践中很少有与BRCA相关的lncRNA生物标志物。
二、材料与方法
1.数据来源
(1)GEO数据库中选择GSE7904、GSE45827、GSE65194、GSE22820和GSE38959
(2)基因表达谱系互动分析（GEPIA）数据库中的TCGA-BRCA队列
(3)从GEO数据库中下载了GSE57297、GSE1299用于验证
(4)LINC00467在BRCA细胞系中的表达水平（CCLE数据）从加州大学圣克鲁兹分校（UCSC）的Xena数据库下载
(5)GEO数据库下载GSE9893，分析LINC00467与BRCA转移的关联
(6)LINC00467在循环肿瘤细胞（CTCs）中的表达，包括GSE41245和GSE55807，从ctcRbase数据库下载
(7)GSE113197是人类乳腺单细胞转录组测序的数据集
(8)从cbioportal数据库下载TCGA-BRCA队列和METABRIC队列中的患者信息数据、LINC00467的表达数据和CNV数据，以及BRCA细胞系中LINC00467的表达数据和CNV数据（CCLE数据）
2.实验流程
(1)基于GEO和TCGA数据库的元分析：使用GEO2R进行差异分析，精确到具有明显差异表达的前10个lncRNAs，并通过R软件包的RobustRankAggreg进行元分析
(2)LINC00467与BRCA的关联分析
(3)单细胞测序（SCS）的数据挖掘：BRCA CTCs的SCS及其相关富集分析均由CancerSEA数据库按照默认参数进行
(4)LINC00467的拷贝数变异（CNV）分析
(5)LINC00467的表观遗传机制：BRCA细胞系MCF7中与LINC00467相关的H3K27ac、H3K4me3和DNA酶的敏感性数据是用UCSC Genome Browser数据库下载并计算的
(6)细胞培养、siRNA转染和5-氮杂-脱氧胞苷处理、RNA分离和定量实时PCR (qRT-PCR)、细胞迁移和侵袭的Transwell试验
(7)WGCNA和通路富集分析
(8)由LINC00467的CNV驱动的竞争性内源性RNA（ceRNA）网络分析免疫细胞浸润的分析：TIMER、ImmLnc
三、实验结果
01 - LINC00467在BRCA中表达量的明显上调
基于GEO进行Meta分析，找出5组基因芯片中差异最明显、表达最稳定的10个lncRNAs（图1a）。选择了5个上调和5个下调的lncRNAs，包括LINC00467和MALAT1（图1b）。来自GEPIA数据库的BRCA的表达数据显示，除了MAIT，所有的lncRNA都有明显的差异表达；但是，MALAT1的差异表达趋势与GEO的基因芯片不一致。基于GEO和GEPIA数据库的基因芯片，认为LINC00467是表达量上调最明显的分子，并选择它进行进一步研究。此外，还在GSE57297中验证了LINC00467的差异性表达（LINC00467的四个探针结果一致，如图1c）。与非肿瘤样本相比，LINC00467的表达在HCC1954和MDA-MB-436的BRCA细胞系中也明显上调（图1d）。根据CCLE数据，LINC00467在正常乳腺上皮细胞系中的表达低于乳腺癌细胞系。这些结果表明，LINC00467可能是BRCA的一个良好的生物标志物。
单细胞测序（SCS）数据显示，在乳腺癌和BRCA中都有多种细胞类型。为了探索LINC00467表达的细胞类型，分别分析了Human Cell Landscape数据库中的乳腺组织和CancerSEA数据库中的BRCA组织的SCS数据，结果显示LINC00467在正常乳腺细胞中的阳性率很低（图1e），而LINC00467在BRCA细胞中的阳性率很高（图1f）。更重要的是，LINC467在BRCA的循环肿瘤细胞（CTCs）中的阳性率为78.57%（图1g），这表明LINC00467可能与BRCA的发生和转移有关。此外，还利用CancerSEA分析了LINC00467与肿瘤相关信号通路的关系，发现LINC00467的表达与BRCA CTCs的分化、静止、炎症和凋亡明显负相关（图1h），提示LINC00467也可能在促进CTCs的生存方面发挥作用。
02 - LINC00467在BRCA中的生物标志物价值
为了探索LINC00467的临床价值，作者基于UCSC Xena数据库分析了LINC00467对BRCA的诊断特异性和敏感性，发现LINC00467的表达可以很好的区分肿瘤和非肿瘤组织（图2a）。此外，GEO的数据分析发现，LINC00467在转移性BRCA组织中的表达明显更高（图2b），具有良好的诊断特异性和敏感性（图2c）。此外，还发现LINC00467在BRCA的CTCs中明显过度表达（图2d）。这些结果表明，LINC00467可能是诊断和转移BRCA的一个很好的生物标志物。
用Kaplan-Meier Plotter分析了LINC00467与BRCA预后的关系。基于对独立数据集的分析，发现LINC00467与BRCA的四个预后参数相关联。LINC00467的表达量越高，BRCA的四个参数就越低（图2e-h）。此外，在K-M Plotter中对多组RFS数据的荟萃分析显示，LINC00467在不同病理类型的BRCA（Basal/LumA/LumB/Her2+）中对RFS有预后价值（图2i-l）。
03 - BRCA中LINC00467的基因组拷贝数扩增
研究证明，很多lncRNAs具有剂量效应，并受到基因组CNV的调控。作者分析了基于TCGA的泛癌图谱中的BRCA数据，发现LINC00467在不同类型的BRCA中有一定的扩增频率，其中浸润性小叶癌的扩增频率最高（图3a）。进一步分析了LINC00467在不同类型的基因组变异中的表达，发现它在增加或扩增的基因组中明显高于删除或正常二倍体样本（图3b），并与其CNV值明显正相关（图3c）。此外，分析了LINC00467的CNV与BRCA的临床病理特征之间的相关性，发现LINC00467的CNV患者更有可能处于肿瘤的晚期IV期和X期（图3d）。LINC00467的CNV也与BRCA患者的预后有关，以及LINC00467拷贝数扩增的患者预后较差（图3e-h）。此外，发现LINC00467拷贝数扩增的患者有更大的基因组片段变化和非整倍体评分（图3i、j），表明LINC00467可能与BRCA的基因组不稳定性有关。同样，在BRCA细胞系中（基于CCLE数据），LINC00467也表现出较高的扩增频率（图3k），并且在有拷贝数扩增的样本中表达量明显更高（图3l）。为了验证上述结果，作者还分析了另一个乳腺癌数据集（TCGA）中LINC00467的CNV，发现LINC00467在BRCA中的拷贝数扩增频率很高，具有剂量依赖效应和拷贝数扩增的患者预后更差。LINC00467的拷贝数扩增的患者也有更高的晚期比例和更多的基因组片段变化。这些结果充分说明LINC00467的基因组扩增可能是LINC00467表达上调的原因之一，LINC00467可能是BRCA的驱动基因之一，其拷贝数扩增也可能是BRCA患者转移和复发的分子生物标志物。
04 - LINC00467的表观遗传学调节
作者基于TCGA BRCA队列分析了LINC00467与其表观遗传修饰之间的关系，发现LINC00467高表达的样本在启动子的染色质开放度也很高（图4a），并且LINC00467的表达与其染色质开放度之间存在密切的相关性（图4b）。此外，LINC00467高表达的患者，其5年总生存率较低（图4c）。这些结果表明，表观遗传调节确实可能与LINC00467的高表达有关。此外，测量了LINC00467启动子的平均甲基化水平，发现它在肿瘤样本中较低（图4d），并与LINC00467的表达明显负相关（图4e、f）。用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-deoxycytidine处理MCF-7细胞后，检测LINC00467的表达，发现LINC00467的表达明显上调（图4g）。还发现H3K27ac/H3K4me3（激活的表观遗传修饰）明显富集，并且在LINC00467启动子附近的DNA酶的敏感度出现峰值（图4h）。这些结果表明，表观遗传修饰，包括甲基化和组蛋白修饰，可能导致LINC00467的高表达。
05 - 沉默LINC00467抑制BRCA细胞的增殖、迁移和侵袭
为了研究LINC00467在BRCA中的生物学功能，在BRCA细胞系中沉默LINC00467后，用转孔实验进行了细胞迁移和侵袭的测试（图5a），发现LINC00467沉默后BRCA细胞的增殖能力明显下降（图5b）。同样发现LINC00467 siRNA的迁移细胞数量明显少于其NC组（图5c），其侵袭能力也明显降低（图5d）。这些结果证实LINC00467可以促进BRCA细胞的迁移和侵袭。
06 - 筛选LINC00467调控的下游信号
为了探索LINC00467调节的下游信号，作者下载了TCGA BRCA队列的数据并进行了WGCNA。首先，用功率值进行过滤，确认3是最合适的功率值。然后，基于基因共表达分析，在合并它们的聚类树后，共得到25个共表达模块（图6a），其中LINC00467在红色模块中。基于共表达的分子通常共同参与一些生物过程或途径，进行了组织特异性和细胞特异性富集分析，发现这个红色模块的基因主要集中在乳腺细胞和BRCA细胞MCF-7中，这与之前在SCS中发现的BRCA细胞中LINC00467的高阳性率相一致。富集分析显示，这些特定的基因主要受TFs如FOXA1/TP53/TWIST1的调控，这与肿瘤的发生或发展高度相关。这些基因的生物学功能主要服务于与细胞的发育、增殖和生长有关的表型（图6b）。最后，KEGG富集分析显示，这些分子主要集中在与肿瘤发生、脂质过氧化代谢或免疫有关的信号通路中，如过氧体脂质代谢、脂质代谢、抗原呈现、P53和NOTCH（图6c）。
作者推测LINC00467也可能通过ceRNA在BRCA中起作用。基于TCGA BRCA队列，利用LnCeVar在线工具分析了由LINC00467介导的ceRNA调控网络，发现LINC00467可以通过多个miRNA调控基因表达（图6d），并进一步形成了一个更多层次的调控网络（图6e），发挥了深刻而持久的影响。随后，富集分析显示，LINC00467介导的ceRNA调控网络功能主要集中在与肿瘤密切相关的生长、凋亡逃逸、迁移/侵袭、免疫逃逸和基因组不稳定性等恶性生物表型上（图6f）。在这些ceRNAs中，有一个重要的分子TGFB2，存在于TGF-β信号传导途径中。而LINC00467和TGFB2之间的表达相关性也在METABRIC数据中得到进一步验证（补充图4D）。TGFB2高表达的BRCA患者的总生存率明显降低（图6g）。此外，有趣的是，TGFB2和LINC00467都位于1号染色体的短臂上（图6h），而且它们在BRCA样本中是共扩增的（图6i）。
07 - LINC00467对BRCA的免疫调节
作者基于TCGA BRCA队列分析了LINC00467与肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的相关性。根据LINC00467的CNV类型进行分组，发现在高度扩增的LINC00467组中，CD8+T细胞、CD8+效应记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的浸润都明显减少（图7a）。同时，CD4+T细胞、CD4+效应记忆T细胞和CD4+中央记忆T细胞的浸润也明显减少（图7b）。这些结果表明，LINC00467的基因组变异可能与免疫细胞的浸润有关。以前的分析发现，LINC00467是一个剂量依赖性的基因。进一步分析发现，LINC00467与BRCA样本的免疫评分和基质评分明显负相关（图7c）。同时，还发现LINC00467与各种免疫细胞，如CD8+T细胞、CD4+T细胞和巨噬细胞的浸润显著负相关（图7d），与TCR信号通路显著负相关（图7e）。基于这些结果，作者推测LINC00467可能是抗肿瘤免疫的一个负调控因子，它通过抑制免疫细胞的浸润来促进肿瘤的进展。
四、结论
本研究基于生物信息学分析，筛选出具有BRCA诊断、转移和复发价值的分子生物标志物LINC00467。此外，还发现LINC00467可能是BRCA中的肿瘤驱动基因，并且可能通过ceRNA假说参与肿瘤免疫和脂质过氧化物代谢的调节（图 8）。靶向LINC00467及其下游信号通路的治疗可能是BRCA药物研发的新方向。