单细胞文献4-血液单细胞转录组学揭示了结核病中自然杀伤细胞亚群的消耗

Single-cell transcriptomics of blood reveals a natural killer cell subset depletion in tuberculosis.

影响因子： 5.736PMID：32114394期刊年卷：EBioMedicine 2020 Mar;53

DOI：10.1016/j.ebiom.2020.102686

文章地址： https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2020.102686

这篇文章思路比较简单，先是介绍了样本采用10×Genomics平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），使用Seurat软件包分析，聚类分为B细胞、T细胞、髓样细胞三个大组，然后再分析了各组细胞亚群的变化及GSVA评分，最后用流式验证，得到了外周血中CD3-CD7 + GZMB +的可以用作区分TB与LTBI和HC的新型生物标记，并没有很深入的分析。例如细胞亚群之间差异基因深入分析、细胞间的互作分析、拟时序分析等等。但是PBMC分群的细胞marker基因还是很有意思的，可以借鉴参考！

摘要：

背景

结核病（TB）仍然是全球重要的健康问题，每年造成数百万人丧生。某些循环细胞亚群被认为可以差异地调节宿主对结核分枝杆菌（Mtb）感染的免疫反应，但这些亚群的性质和功能尚不清楚。

方法

从健康对照（HC），潜伏性结核感染（LTBI）和活动性结核（TB）中分离外周血单个核细胞（PBMC），然后使用10×Genomics平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。使用Seurat软件包基于基因表达谱对细胞进行无监督的聚类，并传递给tSNE进行聚类可视化。流式细胞仪用于验证由scRNA-Seq鉴定的子集。

结果

基于差异基因表达的聚类分析揭示了所有主要PBMC细胞类型的已知标记和新型标记，并描绘了29个细胞亚群。通过比较HC，LTBI和TB的scRNA-seq数据集，作者发现感染改变了TB中免疫细胞亚群的频率。具体来说，作者观察到NK细胞子集（CD3-CD7 + GZMB +）从HC到LTBI和TB的逐渐消耗。作者进一步验证了CD3-CD7 + GZMB +亚群在TB中的耗竭，并发现抗结核治疗后该亚群的频率增加。最后，作者确认该亚组频率的变化可以将TB患者与LTBI和HC区分。

结论

作者建议外周血中CD3-CD7 + GZMB +的频率可以用作区分TB与LTBI和HC的新型生物标记。

介绍

结核病仍然是一个严重的全球健康问题，每年造成数百万人丧生。结核病控制的主要挑战是缺乏将活动性结核病与LTBI区分开的生物标志物。尽管已经做出了很多努力来确定定义TB的血液转录谱，但血液中单个免疫细胞亚群的比例可能会根据疾病或治疗暴露的严重程度而有很大差异。当检查全血时，亚组特异性基因，特别是那些代表少数细胞亚群的基因的巨大波动，也可能被忽略。某些循环细胞亚群被认为可以差异地调节宿主对结核分枝杆菌（Mtb）感染的免疫反应，但这些亚群的性质和功能尚不清楚。

作者以无偏倚，无表面标记的方法对来自HC，LTBI和TB的PBMC进行了scRNA-seq，以描绘单个免疫细胞亚群的转录组谱。作者的数据代表了LTBI和TB中PBMC免疫细胞亚群的第一个基于scRNA-seq的描述。作者在PMBC中发现了29个亚群，并鉴定了这些亚群中的大量其他标记物，这些标记物可作为进一步研究的参考PBMC免疫细胞亚群在结核病发病机制中的作用以及针对结核病的保护性免疫。此外，作者观察到NK细胞亚群，CD3-CD7 + GZMB +从HC逐渐消耗至LTBI和TB。CD3-CD7 + GZMB +的水平敏感且特异，可将活动性结核病与LTBI和HC区分。

作者的scRNA-seq分析证实了以前所做的许多重要观察，并突出了正在进行的关键研究领域和挑战。HC，LTBI和TB中循环的细胞亚群为检查细胞亚群在结核病进展中的作用提供了有用的框架。具有细胞毒性的NK细胞亚群CD3-CD7 + GZMB +可用作区分TB和LTBI和HC的新型生物标志物。进一步剖析与TB相关的细胞亚群（例如CD3-CD7 + GZMB + NK细胞）失调的机制，可能会为针对TB的治疗性干预开辟新的途径。

方法

HC，LTBI和TB采集全血样本第一组包括HC（n  = 2），LTBI（n  = 2）和TB（n  = 3）用于10×基因组学scRNA-seq。第二组包括HC（n  = 81）和TB（n  = 50），第三组包括HC（n  = 39），LTBI（n  = 27）和TB（n = 37）用于流式细胞仪分析（补充附录中的表S1）。

结果

1 scRNA-seq在PMBC中揭示新的细胞类型标记

作者首先从来自七个个体的PBMC悬浮液中分离并测序了总共68,369个细胞，包括两个HC（20,711个细胞），两个LTBI（17,185个细胞）和三个TB（30,473个细胞）。去除了约8.5％的可能代表双峰，空液滴和低质量液滴的细胞（请参阅材料和方法）后，作者提出了62628个细胞进行进一步分析（补充附录中的图1a，图S1和表S2） ）。使用Seurat软件包的无监督聚类[25]在所有三个组中确定了三个不同的细胞簇（图1b和1b）。
簇1（占所有细胞的69.5％）由表达CD3D，CD3E，IL32和CD2的T细胞（图1c和补充附录中的表S3）组成（图1d–f和补充附录中的图S3）。
簇2（所有细胞的~17.3％）包含髓样细胞表达LYZ，S100A9，S100A8，S100A12和CD14（图1的c-e和图S3补充附录中）。
第3组（所有细胞的~13.2％）由B细胞表达CD79A，CD79B和MS4A1（图1的c-e和图S3补充附录中）。

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作者还鉴定了许多其他标记：髓样细胞FCN1，CST4，SERPINA1，MNDA，LST1和MS4A6A。B细胞BANK1，VPREB3，FCER2和ADAM28；T细胞IFITM1，GIMAP7，CD247和LCK。（补充附录中的图S3和表S4）。这些标记物可能是有价值的PBMC细胞特异性标记物，用于将来的分析。

2 结核中髓样和B细胞富集且T细胞耗竭

作者的scRNA-seq结果表明，从HC分离出的PBMC大部分由T细胞（约78％）组成，其次是髓样（约14％）和B细胞（约8％）（图1c和表S3）; 这些频率在LTBI中非常相似（补充附录中的图1c和表S3）。相反，与HC或LTBI相比，TB中的B细胞（〜18％）和髓样细胞（〜23％）的频率较高，而T细胞（〜59％）的频率较低，与HC或LTBI相比（[图1(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235239642030061X#fig0001)c和补充附录中的表S3）。这些在结核病中描述的模式与先前的报道一致[27]，[28]，[29]。此外，在一个独立的队列中，通过常规血液分析进一步证实了TB中淋巴细胞的减少（图1g）。

3 PBMC scRNA-seq可识别13个髓样亚型

TB诱导表达高水平的炎症标记物S100A8，S100A9和S100A12 [的髓样细胞的累积[[30](https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235239642030061X#bib0030)，31 ]。因此，作者更加仔细地研究了第2类髓样细胞，以确定亚群频率在三个供体组（HC，LTBI和TB）之间是否发生了变化。

首先，作者旨在检测定义为经典（CD14 + CD16–），非经典（CD14-CD16 +）和中间（CD14 + CD16 +）单核细胞的三个单核细胞子集[32]，scRNA-seq分析证实了这三个不同单核细胞群体的存在在所有捐助者群体中（图2附录中的a，b和图S4）。

作者还能够基于不同的标记表达将经典的CD14 + CD16-细胞细分为六个亚组（M1-M5）（图2c，d和补充附录中的表S5）。具体来说，M1，M2和M4代表炎性单核细胞，表达高水平的S100A9，S100A12，RETN和S100A8 [33]（补充附录中的图2 d，e和图S5a）。M3含有炎性单核细胞/巨噬细胞，表明其富集IL1B，CCL3和IL8中的[34]。富含PPBP（CXCL7）和PF4（CXCL4）的M5细胞（补充附录中的图2 d，e和图S5a），指示单核细胞迁移和自分泌，受体脱敏趋化因子配体释放[35，36 ]。中间单核细胞（M6）表达高水平的HLA-DPB1，HLA-DPA1和CCL3（补充附录中的表S5）。非经典的单核细胞（M7-M9）共享CDKN1C，RHOC和LYPD2标记表达而不S100A12（图2 d，E，图S5a中和表S5补充附录中）; 这些细胞以前被报道属于CD16 +（FCGR3A）单核细胞[37]。

作者发现DC特异性标记物CLEC10A [37]分布在M6中，但富集于M10中（补充附录中的图S5a和表S5），指示DC样子集。此外，作者还发现了pDC子集M11，其特异性表达了高水平的pDC标记，包括LILRA4，MZB1，ITM2C和CLEC4C [37]，[38]，[39] （图2 d，E，图S5a中和表S5补充附录中）。M12特异富集了间充质细胞样细胞，包括COL1A1，IGFBP7，COL1A2和SERPINH1 [40]（补充附录中的图S5a和表S5）。

作者还发现了一小组巨核细胞样细胞（M13； PPBP，PF4和GNG11）（图2a -d和补充附录中的表S5）[41]。总之，作者的scRNA-seq揭示了髓细胞中具有不同标记的13个子集，尽管这些子集的功能仍有待阐明。这些发现为检查髓样亚群在循环免疫细胞中的作用提供了参考。

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图2来自HC，LTBI和TB的PBMC中的髓样簇。

4 单核细胞的四个子集富含结核

在炎性疾病和癌症中，中间单核细胞CD14 + CD16 +的频率通常会增加[ [29](https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235239642030061X#bib0029)，[42]，[43]，[44] ]。在结核病中，这些CD16 +循环单核细胞更容易产生TNF-α，并响应Mtb感染而死亡[29]。一致地，作者发现在作者的队列研究中，与HC（1.19％）和LTBI（0.9％）相比，TB（2％）患者中M6（CD14 + CD16 +）单核细胞富集（图2b和表S3） 。此外，结核病患者LTBI的M1（〜5.6％），M4（〜4.0％）和M5（〜3.4％）亚组也比HC中更为丰富（分别为〜2.3％，〜1.0％和〜1.7％）（图2b和补充附录中的表S3）。通路分析表明，M1和M5显示出Notch信号下调的Myc-Targets，表明这些细胞已经耗尽。M4和M6亚群的刺猬蛋白信号传导上调，具有强烈的炎症反应（图2f ），提示其免疫活性。总之，作者的数据证实并扩展了TB中CD14 +细胞的丰富性，并进一步揭示了CD14 +细胞的三个子集（M1，M4和M6）在TB中特异性富集。需要进一步的研究来揭示其在结核病中的功能。

5 PBMC scRNA-seq可识别五个B细胞亚群

B细胞在对抗Mtb感染中的作用尚不清楚，只有少数研究解释了它们在TB中的功能[45]。此外，由于难以操纵B细胞，有关B细胞表型和功能的信息受到限制。作者的scRNA-seq分析确定了六个不同的B细胞亚群，每个亚群代表B细胞发育的不同阶段（补充附录中的图3a -c和图S6）：B1和B5表达高TCL1A，CD79A，CD79B， MS4A1水平，缺乏CD27和CD138表达。该表达模式指示滤泡B细胞[ 46，47 ]（图3的c-e和表S6补充附录中）。B2和B4特别富含PMAIP1（NOXA），ABCA6和TCF4（图3 d和e，图S5B和表S6补充附录中），这是B细胞发育和凋亡的激活的B细胞[关键介体48，49 ]。B3表示高MS4A1，CD79A，CRIP1和IGJ水平和低TCL1A，PMAIP1水平，指示成熟B细胞

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（图3 d和e，表S6，图S5B补充附录中）[47] 。

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图3 来自HC，LTBI和TB的PBMC中的B细胞簇

研究已经列举的B细胞在患者TB疾病产生矛盾的结果[ 27，50，51 ]。在作者的scRNA-seq数据中，所有七个B供体的所有五个B细胞亚群都存在，尽管比例是可变的。在这些亚组中，B2和B4在结核病患者中富集（补充附录中的图3b和表S3）。因此，作者通过途径分析来表征B2和B4细胞的功能（图3e）。GSEA分析显示B2和B4在显示高水平的TNFα-，TGFβ-，PI3K-AKT信号传导方面相似，但在WNTβ连环蛋白信号传导和炎症反应方面有所不同，表明免疫功能有所不同（图3e）。这些数据一起揭示了PBMC中五个具有不同标记的B细胞亚群，并且耗竭B细胞（B1）在TB中富集。作者的数据将有助于研究B细胞亚群在结核病中的作用。

6 scRNA-seq可识别9个CD4和CD8子集，并揭示TB中T细胞子集分布的变化

T细胞具有在患者的Mtb控制感染TB 关键作用[52，53 ]。作者的scRNAseq分析在所有三个供体组中检测到43,537个T细胞，这些T细胞可以亚簇化为11个子集（图4 a–d和图S7）。因此，作者尝试根据CellMarker数据库中报道的已建立标志物的表达，为这些亚组中的每一个识别标志物基因，并将其分配给已知的T细胞类型[54]。在11个子集中，有9个子集表达高水平的CD3（图4e）。接下来，作者确定了四个不同的CD4 + T细胞子集：T1，T6，T8和T10（图4a ，d）。T1表达高CCR7水平，表明幼稚样CD4 T细胞[55]。T6和T8均表达高水平的活化CD4 T细胞标记物LTβ（TNFSF3）[56]和其他功能标记物，例如AQP3，GPR183和LDHB（补充附录中的表S7），它们调节T细胞的运输和迁移[ [57]。(https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S235239642030061X#bib0057)，58 ]。GSEA揭示T9表现出较高的肌发生，血管生成，凝血和KRAS信号传导率，表明这些细胞被强烈激活（图4f ）。T6和T8显示了与过氧化物酶体，E2F和MYC-靶标以及糖酵解相关的上调通路（图4f ），表明这些细胞已经耗尽。三个供体组之间的T1，T6和T8频率没有显著差异（补充附录中的表S3）。

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图4 HC，LTBI和TB的PBMC中的T细胞簇

作者还鉴定了五个不同的CD8 T细胞亚群，包括幼稚CD8 T细胞（T5; CCR7）[59]，细胞毒性CD8效应T细胞（T3和T4； GZMH，NKG7和FGFBP2），过渡性CD8效应T细胞（T11； GZMK，KLRB1和LYAR4）[60]和一个小组的巨核细胞样细胞（T9; PPBP，PF4和GNG11）（图4的A-d，图S5C和表S7补充附录中）。[41] 。与LTBI和TB相比，HC中CD8 T细胞亚群的比例略有增加（补充附录中的图4b和表S3）。

7 细胞毒性NK细胞亚群的结核病耗竭

亚群分析还显示了NK细胞的两个不同簇：T2和T7（图4 a–e）。T2和T7表达较低水平的CD3（图4e），表明它们最可能是NK细胞。T2被表达高水平的FCER1G，GZMB，GNLY，SPON2，PRF1，CD7，MYOM2和KLRF1表达（补充附录中的图S5C和表S7），表明具有高细胞毒性活性。T7是在GZMH，FGFBP2，GNLY富集和选择性表达KLRC2（NKG2），表明存memory-like NK 细胞（图4 E，表S7和图S5C补充附录中）[61]。作者发现，NK样细胞亚群之间的某些途径受到差异调节。T2和T7表现出较高的同种异体移植排斥活性以及强烈的IFN-γ和IFN-α反应，表明细胞活化（图4 f）。尽管基于通路分析，T2和T7表现出很高的相似性，但是这些亚组的比例在HC与LTBI和TB患者之间有所不同。具体而言，与HC相比，T2从LTBI逐渐降低至TB；相比之下，T7在LTBI中最常见（图4b）。对结核病T2中上调表达基因的基因本体论富集分析表明，与HC和LTBI相比，结核病T2中细胞死亡途径的调节高度富集于结核病T2中（补充附录中的表S8），这可能是由于TB中的T2。综上所述，作者的scRNA-seq鉴定了两个NK样亚型，它们在三个供体组之间的比例是可变的，并且具有高水平SPON2和MYOM2的细胞毒性NK子集（CD3-CD7 + GZMB +）在结核病中耗竭。

8 CD3-CD7 + GZMB +子集可有效区分TB与HC和LTBI

为了更好地了解T2 NK细胞亚群的性质，作者通过流式细胞仪验证了T2。为此，作者使用了从scRNA-seq数据中识别出的标记CD7，CD3和GZMB来对细胞进行门控。作者首先鉴定出CD3-CD7 + GZMB +细胞均为CD56 +和CD14-CD19-，支持T2包含NK细胞（补充附录中的图5a和图S8）。接下来，作者比较了两个独立队列中HC，LTBI和TB中该子集的频率。结果表明，与HC和LTBI相比，TB患者的CD3-CD7 + GZMB +细胞的频率显著降低（图5b，c）；这一发现与作者最初的sc-RNAseq结果一致（图4b）。为了进一步评估该子集对TB生物标志物的诊断价值，作者在这两个队列中进行了接受者操作特征（ROC）曲线分析。TB vs HC或TB vs LTBI的ROC曲线分析表明CD3-CD7 + GZMB +子集可以作为有价值的生物标志物，曲线下面积为0.93（图5 d，第二组中TB vs HC）0.96（图。 5 e，第三组中TB vs HC），0.85（图5 f，第三组中TB vs LTBI）。作者进一步分析了抗结核治疗后该亚组的发生率。如图5所示g和h，治疗开始后3个月，CD3-CD7 + GZMB +的水平增加。因此，通过scRNA-seq和流式细胞仪，作者证实CD3-CD7 + GZMB + NK细胞可用于将TB与LTBI和HC区分。

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图5 HC，LTBI和TB中CD3-CD7 + GZMB +子集的流式细胞仪分析。

讨论

在这项研究中，作者旨在通过HC，LTBI和TB的PBMC的scRNA-seq了解结核病发展过程中Mtb感染对循环免疫细胞亚群的影响。作者分离出> 60,000并进行scRNAseq，然后进行途径分析以注释供体组之间PBMC子集的性质和频率。在此分辨率下，作者区分了三种主要的细胞类型（T细胞，B细胞和髓样细胞），然后基于定量基因表达将它们亚簇化为29个子集。尽管某些标记物已经为人所知，但作者鉴定了许多其他标记物，包括T细胞的IFITM1，GIMAP7，CD247和LCK，B细胞的BANK1，VPREB3，FCER2和ADAM28以及FCN1，CST4，SERPINA1，MNDA，LST1和MS4A6A用于髓样细胞。

比较HC，LTBI和TB之间的scRNA-seq数据集后发现，疾病导致已知细胞类型的亚群发生变化，尤其是似乎对疾病具有特异性的细胞亚群，例如M1，M4和B2富集且T2耗尽。PBMC的细胞组成在病理性应激期间发生变化[62]，[63]，[64]。一致地，作者的常规血液分析和scRNA-seq证实，HC，LTBI和TB之间循环的免疫细胞频率发生变化。作者的PBMC细胞图谱不仅为人类PMBC的细胞亚群提供了其他见解，而且还为与Mtb感染的不同结局相关的细胞亚群提供了见解。

补充材料

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图S1 PBMC scRNA-seq中细胞捕获和鉴定的一致性。鉴定出的独特分子标识符（nUMI）的数量和基因，跨恢复的细胞类型和nUMI和基因鉴定出的映射到线粒体或核糖体基因的读段所占比例，以及跨所有供体鉴定到的线粒体或核糖体基因的读段所占比例。

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图S2 来自七个捐助者的PBMC的tSNE预测。上图（从左到右）：所有供体合并的PBMC单个细胞，相应的状态（HC，LTBI和TB）。下面板（从左到右）：关联的小区类型，关联的小区类型（HC，LTBI和TB）中的相应状态

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图S3 髓样，T和B细胞已知和新标记基因的表达。（ab）进行差异表达分析，比较PBMC中HC，LTBI和TB的细胞。（a）tSNE；（b）小提琴情节。

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图S4来自七个供体的髓样亚群的tSNE投影。上图（从左到右）：所有供体合并的髓样单细胞，相应的状态（HC，LTBI和TB）。下面板（从左到右）：关联的小区类型，关联的小区类型（HC，LTBI和TB）中的相应状态

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图S5 髓样，T和B子集的已知和新标记基因的表达。（a）髓样亚群；（b）B细胞亚群；（c）T细胞亚群

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图S6 来自七个供体的B细胞亚群的tSNE投影。上图（从左到右）：所有供体合并的B个单细胞，相应的状态（HC，LTBI和TB）。下面板（从左到右）：关联的小区类型，关联的小区类型（HC，LTBI和TB）中的相应状态

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图S7 来自七个供体的T亚群的tSNE投影。上图（从左到右）：所有供体合并的T单个细胞，相应的状态（HC，LTBI和TB）。下面板（从左到右）：关联的小区类型，关联的小区类型（HC，LTBI和TB）中的相应状态

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图S8 CD3-CD7 + GZMB +子集的流式细胞仪分析

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表S1 研究人群的人口统计学特征

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表S2 本研究中包括的七个PBMC样品的scRNA-seq特征。

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表S3 HC，LTBI和TB的PBMC中所有子集的细胞数和频率。

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表S4 通过scRNA-seq鉴定的PBMC主要细胞类型的标记基因

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表S5 通过scRNA-seq识别的髓样亚型的标记基因

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表S6 通过scRNA-seq鉴定的B细胞亚群的标记基因

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表S7 通过scRNA-seq鉴定的T细胞亚群的标记基因

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表S8 结核病T2基因上调的基因肿瘤学富集分析