非因解读 | DSP空间转录组+单细胞核测序揭示新辅助疗法后胰腺癌样本中多重区域功能的变化

                                                                           DSP空间转录组+单细胞核测序

                                                            揭示新辅助疗法后胰腺癌样本中多重区域功能的变化

胰腺导管腺癌（PDAC）作为最为常见的胰腺癌病理亚型，近年来发病率逐步上升，预计到2030年，会成为美国癌症相关死亡的第二大原因。胰腺导管癌预后很差，目前临床治疗采用了越来越多的新辅助疗法，在很大程度上解决了肿瘤细胞微转移的风险，也很好的规避了术后放化疗耐药的出现。因此，深入了解新辅助疗法对术后肿瘤细胞的影响，可以充分认识目前治疗方法的不足，进一步优化新辅助疗法联合治疗方案。

目前用于胰腺癌临床样本的分析技术有诸多限制，而且都不能深入从微环境角度上对PDAC进行多维度分析。非因生物的DSP数字空间组学技术联合单细胞核测序技术，很好的解决了肿瘤微环境研究的痛点和难点。DSP技术是针对肿瘤免疫和肿瘤微环境高精度、多维度分析的新一代空间组学技术，可以在单张切片上通过形态学指导选择兴趣点（Region of Interest，ROI），来实现基于每个ROI微环境的多达90种蛋白或＞1,8000重癌症转录组的原位表达谱分析，其定量效果、通量和可靠性远超传统的以荧光信号为基础的多重免疫组化与多重免疫荧光技术。

2020年8月生物信息学专家Aviv Regov的研究团队利用DSP空间组学技术与单细胞核测序(snRNA-seq)数据相结合，深入的阐明了免疫调节策略和治疗方案的选择，并在《BioRxiv》预印版上在线发表题为“Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment”的文章（图1）。

图1

技术亮点

该研究通过DSP技术，将胰腺导管癌组织样本清晰的勾画为三类区域（ROI）：有免疫和成纤维细胞(CAF)浸润的肿瘤区域、只有CAF浸润的肿瘤区域和只有免疫细胞浸润的肿瘤区域。结合snRNA-seq数据，分析肿瘤区域、CAF区域和免疫区域随着治疗时间的变化相应的功能变化。同时将肿瘤和CAF进行关联，并与不同的局部免疫微环境联系起来，更好的解释了免疫调节策略和联合治疗方案的选择。

研究思路

作者对26例胰腺癌样本进行了snRNA-seq，包含11例接受新辅助疗法的患者样本和15例没有接受新辅助疗法的患者样本。通过snRNA-seq数据分析，强调了治疗组和对照组条件下肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞之间多种潜在的相互作用；然后再结合DSP技术进行了癌症转录组图谱(CTA,1833靶标)的空间分析，将两种样本分了三种不同的区域（ROI），随后又使用全转录组图谱（WTA,18269靶标），对功能基因进行深入研究；最后与snRNA-seq数据结合来分析局部免疫浸润与新发现的肿瘤细胞功能之间的关系。

文章解读

作者对胰腺癌样本做了snRNA-seq分析，由于缺少组织原位空间信息，无法确定癌细胞和CAF固有的功能对于免疫微环境是否起主导调节作用（免疫微环境与癌细胞互作关系），因此如何阐明局部免疫浸润与新发现的肿瘤细胞之间的关系，对于治疗方案的优化会是至关重要的。

为了应对这一挑战，研究者采用DSP技术进行了1833重基因靶标的癌症空间转录组图谱(CTA)分析。两个治疗组的样本通过四色免疫荧光扫描成像，配以对应连续切片的HE图像(图2A)显示了肿瘤内组织结构的空间分布，作者划分了三种不同类型ROI，包括：(1) 有免疫和CAF浸润的肿瘤区域；(2) 只有CAF侵袭的肿瘤区域；(3) 只有免疫细胞浸润的肿瘤区域。ROI直径是600μm，灰色为Syto13 (核染色)，绿色为PanCK (肿瘤细胞)，洋红色为CD45 (免疫细胞)，青色为αSMA (CAF) (图2B)。然后，使用区域划分(Segment)的方式对三类ROI分别进行纯化，并通过NGS二代测序的方法进行定量。

图2 荧光扫描图像与ROI选取策略

作者也将肿瘤细胞和CAF中的差异表达所富集到的细胞功能映射回组织原位上，结果显示在肿瘤细胞区域内DSP与snRNA-seq结果非常一致，这也是对单细胞数据的一个成功验证。经过新辅助疗法治疗的患者样本更倾向于传统分型中的基底样类型，而不是经典型类型 (图3)，更好的说明了免疫调节策略和联合治疗方案的选择。

图3

由于DSP CTA Panel和各种功能基因之间仅重叠269个基因，因此作者使用全转录组图谱 (WTA Panel，18,269种RNA) 对三个未经新辅助疗法治疗的样本进行了分析（图4）。未经治疗的患者WTA和CTA数据中具有一致的表达 (Spearman相关性= 0.54-0.999)，并映射回样本的组织结构中 (图4)。在未经新辅助疗法治疗的组别内，DSP全转录组分析 (WTA)也发现了肿瘤细胞和CAF功能的异质性。每个肿瘤细胞或CAF功能涉及到的基因表达量都有检测，所绘制的圈图将同一功能的基因进行归类注释 (圈图中的片段，左侧示意图)，与之前样本的CTA数据进行整合，划分出肿瘤功能与CAF功能，同时在三种ROI (图2B)区域内作映射，直观反应该ROI内的功能分布。

图4 上皮细胞ROI中各Segment的全转录组分析

研究发现，不同类型的胰腺癌（基底型和经典型）免疫浸润不相同。对各ROI中免疫区域以特定免疫细胞类型的功能模块基因作无监督聚类，观察到不同类型样本中免疫浸润的相关性 (p=0.0339)，而且经典型胰腺癌中的免疫区域巨噬细胞的基因簇表达更高，基底型胰腺癌的免疫区域T淋巴细胞、B淋巴细胞和树突细胞基因簇具有更高的表达 (图5左)。此外，在单个基因水平上，不同类型的肿瘤区域AOI亚型 (经典型与基底型)都有各自显著的特征，与不同免疫细胞谱系限制性和不同调节基因的表达相关 (图5右)。

图5免疫细胞类型特异性和功能模块基因聚类热图

基底型免疫区域AOIs高表达IFNG诱导的趋化因子 (CXCL9、CXCL10、CXCL11)、细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞的标记物 (CD8A、CD3E、CD247、GZMA、GZMB、GZMK、PRF1、NKG7、NCAM1)、细胞毒性T淋巴细胞耗竭免疫检查点标记物 (PDCD1、CD274、LAG3、ENTPD1、TIGIT、IDO1)和调节性T细胞的标记物 (NT5E、FOXP3) (图5右)。相比之下，经典型胰腺癌的免疫区域AOI具有较高的MHC二型(HLA-DQA1/2，HLADOA，HLA-DMA，HLA-DPA1)和巨噬细胞标记物(CD68，CD163，CSF1R)表达。综上所述，这些分析表明两种胰腺癌具有不同的免疫微环境。

文章总结

作者解释了基底型和经典型胰腺癌的肿瘤微环境构成差异，以及它们如何受到新辅助疗法的影响；利用单细胞核测序数据，在经典分类基础上又做了进一步细致的亚型分类，总体来说，新辅助疗法可能会促进肿瘤向基底型或分化型经典亚型的转变。

DSP空间转录组分析进一步支持了这样的假设，即与经典型胰腺癌相比，基底型胰腺癌中肿瘤细胞的功能更适于免疫细胞的浸润。此外，基底型和经典型胰腺癌微环境中的免疫浸润差别也很明显，因此建议针对这些表型的差异化采取相应的治疗策略，前者可能更适于免疫检查点抑制剂，后者更适于骨髓定向疗法，如CD40位点激动剂和TGF-beta调节因子两类靶点。

非因生物作为国内首家引入DSP空间多组学技术的公司，搭建了一套完整的空间多组学方案，解决了肿瘤微环境研究的难点与痛点。DSP技术的基本流程如下：1.寡核苷酸通过可紫外线光裂解接头共价偶联一抗或mRNA杂交探针进行原位捕获；2.通过形态学指导进行ROI（兴趣区）划分后，对ROI进行紫外光解并收集兴趣点区域靶标上的寡核苷酸序列；3.解离的寡核苷酸再通过杂交法经由nCounter计数或采用建库方法实现与二代测序的对接，从而对蛋白质或RNA进行高通量检测。