10X Genomics V(D)J测序：免疫分析从零起步学（三）

哈啰大家好！~是我是我！我又来给大家更新了！

上回书说到，测序数据下机经过了配套的分析流程cellranger的洗礼之后，生成了一系列的结果文件。闲言少叙，这一期我们就来看这些结果文件的解读。

首先要说的第一个是总览的summary。这个summary有两种呈现方式，一个文件是网页web文件，另一个是个Excel表。可读性来说，还是网页文件方便查看一些。

以10X官网上的示例数据为例。网页总览结果打开之后大致呈现为这个样子。如果数据本身有非常大的问题，某个指标严重不合格的话，在这个页面上方会有一个橙黄色的warning。

整个summary有两个选项卡，Summary选项卡就展示一些基本的指标，大多和数据质量或者测序质量有关。涉及到reads条目，基因数目，细胞数目，测序饱和度，比对百分率等各类信息。具体每个数据代表什么信息，在分类选项卡旁边的小问号上点击一下，下拉菜单里会有非常详细的解释。

另外一个Analysis选项卡里面，则展示了这个样本中，出现频率最高的前十个克隆型，以及它们的CDR3序列等详细信息。这部分结果在可视化程序中展现的更好，因此这里先不细讲。

接下来，我们看下结果文件中的这一堆表格。

先看clonotypes.csv，这个表格里面是该样本每一个clonotype的描述，一共包含五列。

clonotype_id：是这个样本内部依次排下去的序号，不同样本之间不通用！！！不通用！！！就比如西班牙有个人叫Mary，德国也有个人叫Mary，但是她俩不是一个人。所以相同clonotype_id在不同样本之间不代表同一克隆型，这个一定要切记。

frequency：这个表示这个克隆型在样本中的多少个cell中被检测到，侧面部分反映了这个BCR的丰度。为什么说是部分反映呢，因为受到测序深度等方面的限制，可能会miss一些高频克隆型，因此这个参数有意义，同时也有局限性。

proportion：clonotype表达的细胞数占样本细胞总数的比例。

CDR3区域的氨基酸构成。

CDR3区域的核苷酸组合。

既然是亲妈级教程，我这里来简单说一嘴CDR3区域是啥。

如图，CDR3是V(D)J基因编码的核心区域，通常会包含V基因的一部分，然后D基因，还有J基因的一部分，因此是BCR或者TCR上最具有代表性的，最具有辨识度的一段区域，相当于一个人的脸。在绝大多数免疫研究中，会把CDR3序列作为定义和识别某一个特定BCR或者TCR的唯一依据。

metrics_summary.csv文件，和网页版的summary几乎是一回事儿，这里不讲。

接下来说一下这几个annotation.csv文件。这几个文件大同小异，侧重不同层面对数据进行注释和解读。以filtered_contig_annotation.csv文件为例：

怕大家看不清我分两部分进行截图。这个文件里面的内容就比clonotypes.csv文件丰富很多。列举了每一个细胞（barcode）所对应的clonotype的详细信息。提供了V基因和J基因的具体片段，但D区通常较短又突变较多，因此受技术限制，常常捕捉不到。

这里每一列的含义受篇幅限制就不一一给大家阐述了。但本着送佛送到西的一贯原则，我给大家指路官网的结果信息解读网址：https://support.10xgenomics.com/single-cell-vdj/software/pipelines/latest/output/overview 里面有非常详细的介绍，大家可以善用翻译软件，自行学习。

结果文件夹中的fasta序列文件，存储每个clonotype的contig序列或者consensus序列。consensus序列可以理解成这个样本里，这个克隆型的所有细胞的序列的统一。就是假如这个克隆型在这个样本里表达了十个细胞，和reference比起来，有九个细胞的某个位点都由A突变成了T，而剩下的一个是由A变成G，那么consensus序列的这个位点就是T。它不是reference序列，而是样本内部的一种统一，这样做能有效排除个别细胞中低频SNP的干扰。

最后，我想就clonotype的问题给大家多说一点儿。这部分也是我自己工作中确实遇到的困惑。在10X系统中，对于相同clonotype的定义是，CDR3区域的核苷酸排序完全相同。之所以用核苷酸不是用氨基酸，想必大家都能理解，因为有的氨基酸密码子不止一种。

但是在查看结果的时候我发现，有的clonotype是用重链和轻链的CDR3区域共同定义的，而有的clonotype是只用一条重链或者一条轻链（常见）定义的。针对这个问题，我写邮件问了10X总部（不得不说这段时间我英语写作能力被迫得到了极大的提升），得到了如下回应。

如图所示，clonotype-1和clonotype-2都是由两条链定义的，但因为测序深度和捕获效率等问题的限制，对于第三个clonotype，我们只捕捉到了其中的一条链。即使这条链与clonotype-1其中一条链相同，但因为另一条链的信息未知，因此还是将其识别为一个新的克隆型。所以，我们的结果数据中，其实理论上存在一部分假阳性。

除此之外，还存在一些多链克隆的结果，即一个clonotype包含多于两条链的情况。针对这个问题，10X官方给我的回应是：包含三条链的克隆型是一种自然生物界的正常现象，这种克隆型含量少，但在正常生理条件下确实存在。而如果clonotype包含更多链，比如4条或以上，那么就要考虑是技术问题或者人为误差。通常情况下，这种clonotype在cellranger3.1.0以上的版本中会被去除。

好了，不知不觉我又写了这么多。原本想这一次能把这个系列完结，但是可视化结果还没有说到，Loupe的使用也没有提到，转录组和免疫组的联动分析也没有说。毕竟我自己从入门到上手学了半个月有余，理解起来也不是一蹴而就的。所以还请各位看官多点儿耐心~我会好好的，尽量把我能想到的，都分享给大家的，笔芯~~

那我们就下一期再见咯！~古德拜！~