2014.5 南昌大学专硕毕论 - NIPT名词和原理的学习

胎儿游离 DNA(cell free fetal DNA，cff DNA)的确切来源目前尚不清楚，可能有以 下几种机制：

• 孕妇血液中的胎儿有核细胞
• 凋亡的胎儿组织细胞
• 来源于胎盘滋养细胞（最可能）

Lo 因产妇生产后2h后就检测不到胎儿DNA，证实胎儿DNA是由胎盘滋养层细胞被破坏后直接释放至母体血液的可能。

cff DNA 仅占母体血浆游离 DNA 总量的 5％-30％，并随着孕周的增大而增多；DNA 片段大小 75-250 bp。游离 DNA 半衰期仅为 16.3 分钟，分娩 2 小时后母血中的 cffDNA 即完全降解。

无创假阳的原因：

• 母体自身嵌合体核型
• 母体恶性肿瘤
• 限制性胎盘嵌合体
• 双胎中一胎停育

限制性胎盘嵌合体(confined placental mosaicism,CPM)，即胎盘出现正常与异常的染色体嵌合体，而胎儿核型正常。发生机理主要是合子形成后，体细胞有丝染色体不分离，这种现象只发生在分化为胎盘组织的细胞系，异常核型只能出现在胎盘组织，而胎儿其他组织细胞核型均正常。

CPM根据异常细胞系在胎盘的分布不同分为三种类型：

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• Ⅰ型异常核型出现在细胞滋养层；
• Ⅱ型异常核型出现在绒毛基质内；
• Ⅲ型异常核型分布于细胞滋养层和绒毛基质内

嵌合体的发生机理：

• 有丝分裂起源：在合子形成后，体细胞有丝染色体不分离，正常的胚胎里产生三体核型

• 减数分裂起源和三体自救：合子为三体，通过三体自救或者单亲二倍体（uniparental disomy,UPD）形成嵌合体。

  【三体自救或者三体形成UPD或者形成正常细胞，如下图！】

UPD单亲二倍体：指在一染色体核型中，某一对同源染色体或染色体上的某一片段均来源于双亲中的一方．而没有另一方该染色体存在，其发生机制三体自救、配子互补、单倍体复制等。

UPD可能引起的不良后果有：（可能无任何不良表型后果）

• 因三体自救不完全，导致胎儿发育异常或因CPM导致的胎盘功能不全；
• 某些染色体隐性遗传病携带者的后代由杂合子变成纯合子而患病；
• 存在印记基因的染色体发生UPD导致遗传综合征。

UPD解决方法和特征：

• 临床上当绒毛穿刺（ chorionic villus sampling, CVS）或无创DNA产前检查（Noninvasive prenatal testing，NIPT）核型结果提示嵌合体时，需要进一步行羊水染色体检查，明确胎儿染色体核型。针对某些可能因UPD导致不良表型的染色体，如6、7、11、14、15号染色体等，需要考虑进一步分子诊断明确是否存在胎儿UPD的可能。
• Ⅰ型和Ⅱ型CPM主要是由体细胞有丝染色体不分离引起，单亲二倍体的可能性很小。
• Ⅲ型CPM与三体自救和单亲二倍体有关，胎儿很可能发生产前和围产期并发症。

形成合子后的不同时间的染色体畸变：（染色体畸变的类型取决于畸变累及的细胞系及畸变发生的时期两个方面）

• 受精后的24h内：配子形成期或合子期发生的染色体畸变，将导致整个个体带有畸变的染色体，即形成各种常见的单体型、三体型、部分单体型、部分三体型、三倍体、多倍体等各种类型的染色体病患者；
• 受精后3-4d：在胚胎早期的卵裂及桑椹胚期发生的染色体畸变，将导致某一个体发育成 含有不同百分比核型的嵌合体的染色体病患者，其后由于3个胚层的分化，某一胚层发生的染色体畸变，将累及由此胚层发育而来的有关器官、系统。
• 八细胞胚阶段与囊胚阶段：，位于内层细胞将形成内细胞团而不是外周细胞，胚泡的外围形成绒毛膜，胎儿是由内层细胞中的三个细胞发育而成，其余的细胞将形成胚外结构，如卵黄囊、尿囊及部分羊膜囊等，因此，选择不同的细胞系将导致不同的嵌合体类型
• 滋养层与内细胞团分化之前：嵌合体将出现在胎盘与胎儿中；
• 当畸变发生在胎盘与胎儿分化之后：嵌合体核型限制性出现在胎盘或者胎儿中，而不是同时出现。嵌合体核型出现在胎盘中，而胎儿核型正常，这样就形成了CPM。

CPM影响：

• CPM 对胚胎的影响，与异常染色体发生的时机，染色体异常类型，异常染色体的数量及活性，以及受影响组织的位置等有关。
• 影响范围很广，可以是正常的胎儿，也可导致胎儿生长受限，甚至是胎儿宫内死亡在CPM中流产率高于22%，9.3%的胎儿宫内生长受限及 16%-21%的胎儿存在产前和围产期并发症。
• CPMⅠ型是最常见的一种类型，可能与自然流产、胎儿宫内生长受限有关。
• CPM II 型也比较常见，但对胎儿发育的影响尚不清楚[9]。【该孕妇在孕期通过 B 超及产科检查严密监测胎儿生长发育情况，并未发现异常。】

较常应用的分子生物学技术：

• 荧光原位杂交技术，主要是间期核上显示杂交信号，快速 进行非整倍体的识别；
• 比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)技术，可在全部染色体或在染色体亚带水平上，对不同基因组间DNA序列拷贝进行检测、定位，从而可以快速检出并提供有关染色体三体、单体或染色体大片段拷贝数变化的信息；
• 微阵列比较基因组杂交技术(Array-CGH) ，可以发现微量嵌合体[19]。本案例羊水荧光原位杂交结果显示为46，XN。

FISH ：

• 技术是利用染色体特殊区域特异性DNA或中期染色体DNA进行杂交，用荧光作为检测系统进行检测的一种原位杂交方法，以其简便、快速、敏感等优点，广泛用于染色体数目与结构畸变甚至基因水平畸变的诊断。
• 原理：将荧光标记的核酸分子在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性，而后通过荧光显微镜观察荧光信号，在维持原位的前提下对靶核酸进行分析，检测染色体数目和结构异常。

与传统的细胞遗传学方法相比，其优势在于：

• 无需细胞培养，间期细胞即可用于杂交分析。
• 检测时只需计数间期细胞核上不同的杂交点，比传统的核型分析操作简单。
• 与核型条带分析方法相比，运用特定DNA探针检测更敏感，更具特异性。特别是对染色体微小片段异常的检测，更有针对性。也可检测和定性标记染色体。因此FISH非常适用于临床染色体异常疾病的产前诊断。

劣势：

• 因未培养的间期细胞无典型的染色体结构；
• FISH探针位点和数目的限制，对染色体结构异常的诊断能力有限，因此，染色体13，18，2l，X和Y荧光原位杂交技术不能成为染色体结构异常的独立检测，尤其是对夫妻一方有染色体结构异常的患者仅采用染色体13，18，21，X和Y荧光原位杂交检测很危险的

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