hello，大家好，今天我们继续分享单细胞空间的分析内容，不过我们今天重点放在免疫部分，参考文献在Resident memory CD8+ T cells in regional lymph nodes mediate immunity to metastatic melanoma，2021年9月发表于Immunity,IF37分，专门针对免疫研究的文章，我们今天来好好看看，看看作者是如何将单细胞转录组、VDJ、空间三项技术整合在一起攻克生物学难题的。
研究人员利用黑色素瘤相关的白癜风小鼠模型研究了常驻记忆（Trm）和循环记忆（Tcirm）细胞在转移位置的抗肿瘤反应中的作用。研究人员发现，肿瘤特异性CD8+ T细胞的转录特征是由占据的组织决定的。异种共生表明，肿瘤特异性的Trem和Tcirm区段在整个内脏器官中持续存在，但Trem细胞在淋巴结（LN）中占主导地位。淋巴结和皮肤中Trem细胞的单细胞RNA测序图谱是不同的，占据这两种组织的T细胞克隆型在淋巴结中绝大部分保持为Trem细胞。
虽然Tcirm细胞阻止了黑色素瘤在肺部的生长，但Trem对黑色素瘤在LN的播种提供了长期的保护。扩大的Trem population也存在于黑色素瘤患者的LN中，其转录特征预示着更好的生存。因此，肿瘤特异性Tram细胞在LN中持续存在，从而限制了转移性癌症。
In brief
Lymph nodes (LNs) are frequent sites of metastasis. Molodtsov, Khatwani et al. find that melanoma-specific CD8+ T cells persist as functional resident memory (Trm) populations within skin-draining LNs, and these Trm cells prevent melanoma growth upon tumor seeding in LNs. A LN Trm transcriptional signature predicts survival in melanoma patients, highlighting the relevance of LN Trm function in human disease.
Highlights
- Tissue localization defines the transcriptional profile of tumor-specific CD8+ T cells
- Melanoma-specific Trm populations develop in skin-draining lymph nodes
- Trm cells protect against melanoma tumor seeding in lymph nodes
- A lymph node Trm transcriptional signature uniquely predicts survival in melanoma patients
SUMMARY
随着原发性肿瘤的进展和转移，抗肿瘤免疫反应的性质会发生变化。研究使用黑色素瘤相关白斑的小鼠模型研究了resident memory (Trm) 和circulating memory (Tcirm) 细胞在转移部位的抗肿瘤反应中的作用。发现肿瘤特异性 CD8+ T 细胞的转录特征由占据的组织defined。Parabiosis显示肿瘤特异性 Trm 和 Tcirm compartments在整个内脏器官中持续存在，但 Trm 细胞主导淋巴结 (LN)。 LN 和皮肤中 Trm 细胞的单细胞 RNA 测序谱是不同的，占据两种组织的 T 细胞克隆型在 LN 中绝大多数保持为 Trm。 Tcirm 细胞阻止黑色素瘤在肺部的生长，而 Trm 提供了针对 LN 中黑色素瘤seeding的长期保护。来自患者的黑色素瘤相关淋巴结中也存在扩大的 Trm population，它们的转录特征预测了更好的存活率。因此，肿瘤特异性 Trm 细胞在 LN 中持续存在，限制了转移性癌症。（T细胞的分类实在太多了一些）
INTRODUCTION
转移是癌症死亡的主要原因，尽管对转移部位的免疫反应尚不清楚。 CD8+ T 细胞充当小鼠早期癌症的守护者，抑制癌细胞的扩散，T 细胞激活免疫检查点抑制剂药物对广泛转移性疾病的患者有效。 记忆 T 细胞对于对癌症的持久免疫特别重要，并且与患者的较低转移率有关。
尽管作为 T 细胞启动的必要器官，淋巴结 (LN) 却是最常见的早期转移部位。 Tumor-draining的 LN 变得高度免疫抑制，并且 LN 脉管系统独特地能够将肿瘤细胞传播到远处器官。将 LN 指定为转移的途径强调了了解 LN 局部对癌症的免疫的必要性。 这种免疫的存在是通过以下发现来推断的：一些转移瘤从未扩散到 LN 的包膜下区域之外，并且全区域淋巴结 (RLN) 切除对转移性黑色素瘤患者缺乏治疗益处。
在 LN 中启动 CD8+ T 细胞后，克隆扩增的population分化为循环和常驻记忆亚群。循环记忆 (Tcirm) 细胞——包括中枢 (Tcm)、效应细胞 (Tem) 和干细胞记忆 (Tscm) 亚群——通过血液和淋巴器官再循环，而常驻记忆 (Trm) 细胞群在组织中稳定驻留。与 Tcirm 细胞相反，Trm 细胞表达组织保留标志物，缺乏egress markers的表达，并且在功能上被定义为它们无法在稳定状态下再循环。 Trm 细胞存在于整个组织中，包括皮肤、肺、肝、脑、肠和生殖道，在这些组织中它们提供了抵御外周再感染和癌症的屏障。此外，CD8+ Trm 细胞也可以占据 RLN。在人类免疫缺陷病毒 (HIV) 感染的患者中，HIV 特异性 CD8+ Trm 细胞在elite controllers的 LN 中富集，表明 LN Trm 细胞在对抗感染中的作用。
Tcirm 和 Trm 细胞介导的癌症免疫研究主要集中在原发性肿瘤上，而对转移部位的memory requirements知之甚少。 之前的工作揭示了皮肤 Trm 细胞在小鼠皮肤黑色素瘤的长期保护中的关键作用。 其他研究人员已经表明需要 Trm 细胞对抗粘膜部位的肿瘤，尽管 Trm 和 Tcm 细胞之间的相互作用在其他情况下可能至关重要。 肿瘤内 CD103+ Trm 样细胞与改善预后和增强免疫治疗反应相关。 然而，Tcirm 细胞也与改善的结果有关。 Tcirm 和皮肤 Trm population共同构成了患有白斑病的黑色素瘤幸存者的持久免疫治疗反应的基础。
在这里，分析使用已建立的黑色素瘤长寿命免疫模型和相关自身免疫检查了 Trm 细胞对转移部位黑色素瘤免疫的贡献。 Trm 和 Tcirm compartments均在整个淋巴和内脏转移部位产生，但与受 Tcirm 细胞有效保护的肺不同，RLN 中的肿瘤保护主要由转录上不同的 LN Trm 细胞群提供。 这些研究表明，肿瘤位置定义了保护性记忆反应的最佳特征，并表明 Trm 细胞是 LN 内癌症免疫的关键介质。
RESULTS
Tissue location dictates the transcriptional characteristics of tumor-specific memory T cells
为了研究 CD8+ T 细胞对转移部位肿瘤的反应，利用已建立的手术后黑色素瘤相关白斑 (MAV) 小鼠模型。 为了响应 B16 真皮肿瘤生长和用抗 CD4 治疗以消耗 Treg 细胞，小鼠打破了对黑素细胞分化抗原 gp100 和 TRP-2 的耐受性。 在手术切除原发肿瘤后，这些小鼠会发展为自身免疫性白癜风，这是维持 LN 和皮肤中针对 gp100 和 TRP-2 的记忆 CD8+ T 细胞反应所必需的。 在患有 MAV 的小鼠中，黑色素瘤保护在dermis中持续存在，并防止肺部静脉注射 (i.v.) 再激发。 皮肤肿瘤保护由皮肤中的 Trm 细胞提供。 为了识别其他组织中的肿瘤抗原特异性 CD8+ T 细胞，在 MAV 诱导之前引入了 104 个初始 pmel 细胞的示踪population。 这些sentinel pmel 细胞反映了 MAV 小鼠的内源性 CD8+ T 细胞反应。
在肿瘤切除当天评估启动，抗原经历 (CD44hi) pmel 细胞已经分布在整个组织中。 正如预期的那样，在皮肤中检测到最高的 pmel 比例。 然而，pmel 细胞也在肺、肝和淋巴结中大量积累。 四十五天后，整个组织中的记忆群仍然很明显。 在灌注的肺和肝脏中，体内 mAb 染色揭示了实质和血管相关 pmel 记忆群的存在。 相对于启动，脾、肺和肝脏的记忆反应收缩，尽管它们在 LN 中保持不变，并在自身免疫性皮肤中膨胀。 因此，在存在皮肤局部自身免疫的情况下，在宿主淋巴组织和内脏器官中形成了强大的肿瘤特异性 T 细胞记忆。
然后，使用 CD103+CD69+CD62Llo 皮肤 Trm 细胞作为参考population评估了记忆时组织定位的 pmel 细胞的表型。 虽然 CD103 和 CD69 在皮肤的 pmel 细胞上表达最强，但它们在 LN 中也高度表达。 脾脏、肺和肝脏中的 Pmel 细胞也表达 CD103 和 CD69，但水平低于皮肤或淋巴结。 CD62L 在所有组织中的 pmel 细胞中基本上不存在，证实该模型中不存在稳健的 Tcm compartment。 CD103+CD69+CD62Llo Trm 表型是 MAV 环境中 pmel 细胞所独有的，因为它与过继转移之前的幼稚 pmel 细胞不同，并且与在表达 gp100 的单纯疱疹病毒感染背景下产生的 pmel 记忆群不同 . 因此，肿瘤特异性记忆 T 细胞在所有组织位置表达 Trm 标志物，尽管水平不同。
为了识别不同位置的肿瘤特异性 T 细胞之间的差异，从不同组织中分选 pmel 细胞并通过bulk RNA-seq 进行分析。对组织间表达差异最大的转录物的分析揭示了组织特异性转录特征。皮肤中的 Pmel 细胞表达最高水平的 Atf3、Zfp36 和 Fabp4/5，后者对于皮肤中的 Trm 代谢至关重要。另一方面，来自肺的 pmel 细胞表达 Gzma、Itgax (CD11c) 和 Fabp3。这与肝脏形成对比，肝脏中细胞表达 Fabp1 和 Fabp7，前者促进肝脏中的 Trm 细胞维持。来自 LN 的 pmel 细胞表达与 IL-7 信号（例如，Il7r、Stat5a 和 Bcl2）和 1 型 IFN 信号（例如，Stat1 和 Irf3）相关的转录本。在启动/效应时间点取自 LN 的效应 (Teff) pmel 细胞中未观察到这种特征，表明它是记忆所独有的。因此，克隆相同的记忆 T 细胞群采用基于其占据组织的独特基因表达谱。
为了更好地了解组织内记忆 T 细胞亚群的分化，关注与 Trm、激活/效应子和 Tcirm 亚群相关的转录本。对于 标记，初始 pmel 细胞或肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 为低转录本或缺失转录本提供了Trm参考。正如预期的那样，来自皮肤的 pmel 细胞表现出 Trm 转录本的显著表达，因此缺乏大多数 Tcirm 转录本，而这些转录本由对照naive (CD44lo) pmel 细胞高度表达。皮肤 pmel 细胞也表达了高水平的激活/耗竭转录本，这些转录本在 TIL 中高度表达。这与来自脾脏的 pmel 细胞不同，后者表达较低水平的大多数 Trm 和激活/耗竭转录本，同时表达高水平的几种 Tcirm 转录本。另一方面，肺、肝和淋巴结中的 pmel 细胞通过已知特征不太清楚。尽管这些population中的每一个都表达了高水平的多个 Trm 标记，但它们同时表达了中等水平的激活/耗竭标记和中等或高水平的几个 Tcirm 转录本。因此，即使在单个组织位置，肿瘤特异性记忆 T 细胞的异质population也存在于克隆一致的population中。
Tumor-specific CD8+ T cells differentiate into Trm populations within LNs and lungs
为了最终确定单个组织中 Trm 和 Tcirm subset的存在，进行了共生研究。 含有记忆 pmel 示踪剂population的 MAV 供体小鼠与具有同类标记的 MAV 受体共生结合 14 天。 这足以建立血管吻合，在第 30 天时不会进一步增加。考虑到总 CD8+ T 细胞，初始 (CD44lo) 和记忆 (CD44hi) compartments的平衡在连体小鼠的脾脏、LN 和肺中都很明显。 尽管有大量的内源性 Trm population，但肝脏也达到了平衡。 皮肤 CD8+ T 细胞未能平衡，这与受白癜风影响的皮肤中存在 Trm 细胞一致。
正如预期的那样，专注于 Ag 特定的 pmel population，在皮肤中没有观察到平衡。 然而，脾脏中的 pmel 细胞完全平衡，表明它们的身份为 Tcirm，这与它们通过bulk RNA-seq 表达的组织出口分子一致。 相比之下，肺 pmel 细胞仅部分平衡，表明它们包含 Tcirm 和 Trm subset。 此外，再循环肺population的表型主要是 CD103loCD62Llo，与这些细胞是 Tem 一致。 受体小鼠肝脏中的 Pmel 种群小于供体，表明 Tcirm 细胞在肝脏中普遍存在，但不排除 Trm 亚群的存在。 总之，这些数据表明肿瘤特异性 Trm 和 Tcirm 细胞的组合占据了 MAV 小鼠的内脏器官。
出乎意料的是，共生研究进一步揭示了 LN 中存在大量肿瘤特异性 Trm population。大多数 pmel 细胞未能在腹股沟淋巴结中平衡，并保留在具有 CD103hiCD62Llow 表型的供体中。在 LN 中仅检测到少量再循环部分，其特征在于 CD103loCD62Lhi/lo 表型。 LN Trm 种群随着时间的推移是稳定的，这表明即使在 30 天的共生之后也达到最小平衡。使用naive受体交替进行联体共生导致类似的结果，表明受体小鼠的白斑病既不阻止也不促进 pmel T 细胞驻留或再循环。所有引流皮肤的 LN 都含有 pmel Trm 群，而肠系膜 LN 完全缺乏 pmel 细胞，这表明靠近皮肤可能对 LN 中的 Trm 建立很重要。在引流先前肿瘤切除部位的 RLN 中观察到最大的population。在这里，大多数 pmel 细胞是 Trm，但也有少量的再循环细胞群。这些研究揭示了以前未被重视的肿瘤特异性 Trm 细胞群的存在，这些 Trm 细胞在 LN 中持久存在。
Transcriptional single-cell analysis reveals diverse memory T cell populations throughout tissues(转录单细胞分析揭示了整个组织中不同的记忆 T 细胞群)
为了更好地表征 Trm 和 Tcirm population的异质性，使用 10X 平台通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 分析从不同组织中分选的 pmel T 细胞。 Pmel 细胞根据它们的起源组织清晰地聚集在一起，除了一个包含来自所有组织的细胞的混合小cluster。一般来说，scRNA-seq 的标记表达与流式细胞术和批量 RNA-seq 一致。正如预期的那样，来自皮肤的细胞表达 Trm 标记（例如，Itgae、Cd69、CXCR6 和 NR4A1）并且缺乏 Tcirm 标记（例如，Klf2 和 S1pr1）。根据 Stmn1、Mki67 和 Mcm3 等基因的表达推断，混合cluster包含增殖细胞。来自皮肤和肝脏的细胞各自形成单一的同质cluster。从皮肤中分离出的 pmel 细胞重新聚集几乎没有异质性，所有细胞都具有 Trm 特征，与它们的共生行为一致。然而，肝脏的重新聚类揭示了两个通过 Klf2 表达区分的cluster，表明肝脏中同时存在 Tcirm 和 Trm 亚群。
即使聚集在更大的数据集中，肺和淋巴结中的 Pmel T 细胞也是异质的。 Lung 包含三个clusters，Lung_1 和 Lung_2 均表达 Tcirm 相关转录本 S1pr1 和 Klf2，以及高水平的 Gzma 和 Gzmb。 较小的 Lung_3 cluster表达 Bcl2、Bbc3、Pim2 和 Ddit3，类似于最近报道的肺气道 Trm特征。 因此，与共生数据一致，肺具有转录不同的 Trm 和 Tcirm populations。 值得注意的是，肺和肝 Tcirm 样细胞群在转录上是不同的，这表明它们并不代表来自血液的污染物，而是 Tcirm 细胞与组织相互作用到一定程度改变了它们的转录谱。
LN 还包含三个cluster。 LN_1 是最小的，表达 Cd28、Klf2、Slamf6、Tcf7 和 Tox，但缺乏 Itgae，与循环 Tscm 样或祖细胞耗竭细胞一致。 相比之下，较大的 LN_2 和 LN_3 cluster具有高 Itgae 和 Cxcr6 以及低 Klf2 和 S1pr1，使它们与 LN Trm cluster对齐。 与皮肤 Trm 细胞不同，LN Trm 细胞缺乏 Nr4a1、Fos 和 Tnf，而是表达高 Il7r、Lta 和 Cxcr3。 有趣的是，LN_2 与 LN_3 仅通过与 1 型 IFN 信号相关的转录本的表达来区分，这与大量 RNA-seq 数据一致，并表明 LN_2 是暴露于 1 型 IFN 的 Trm 亚群。 因此，在 LN 中的肿瘤特异性记忆 T 细胞克隆群中存在转录异质性。
为了识别组织中记忆clusters之间的转录相似性，使用 Monocle 进行伪时间排序。 populations形成了三个不同的分支，肺和肝在很大程度上重叠，与皮肤或 LN 不同。Based on distance and trajectories, the main LN Trm cluster (LN_3) appeared most similar to skin Trm cells, with the LN Tcirm cluster being more distinct。 然而，基于 RNA 速度分析，皮肤和 LN Trm populations之间不存在明显的分化关系。 因此，虽然 LN 和皮肤population共享多个特征，但 LN Trm 细胞是转录上不同的记忆populations。
这里多说一句，气泡图有负值，说明是对基因表达值标准化后绘制的结果。
LN Trm cells are functional, prevalent, and present in the endogenous T cell compartment
在先前肿瘤切除的 RLN 引流部位内更仔细地检查了肿瘤特异性 T 细胞的定位和表型特征。 RLN 的免疫荧光显微镜显示 pmel T 细胞定位在 T 细胞区内，类似于naive和 Tcm 细胞。 然而，在包膜下窦中表达 CD169 的巨噬细胞附近的cluster中也观察到细胞，这与病毒感染模型中的 LN Trm 定位一致。 T 细胞区和包膜下窦内的 Pmel 种群表达 CD103，表明 Trm 种群在整个 LN 中的分布。
基于测序和共生数据，LN Trm 细胞通过 CD103 表达与其 LN Tcirm 对应物区分开来。 为了定义额外的表型特征，分析了表征来自 scRNA-seq 数据的 LN Trm cluster的标记的表面表达。 IL-7R (CD127)、CXCR6 和 CXCR3 的显著更高表面表达将 CD103+ Trm 细胞与 LN 中的 CD103- Tcirm 对应物区分开来。 为了解决这些亚群之间功能性的潜在差异，在 MAV 诱导之前，小鼠被过继转移了表达 IRES-eYFP IFNg 报告基因的 pmel 细胞。 引人注目的是，对未再刺激细胞的快速离体分析表明，尽管 CD103-Tcirm 亚群中明显不存在，但 IFNg 在 LN 中的 CD103+ Trm 细胞中的表达一致高。 这些数据突出了 LN Trm 细胞作为表型和功能不同的肿瘤特异性 T 细胞群，准备在 LN 内发挥效应子功能。
尽管上述研究评估了转基因 pmel 细胞群，但了解 Trm 群是否也包含 LN 中的内源性抗肿瘤反应至关重要。首先，分析了 MAV 小鼠淋巴结中存在的内源性 TRP-2180-188 特异性 T 细胞。由于这些populations很小，因此在表型分析之前对 RLN 进行了 TRP-2 四聚体富集。事实上，类似于皮肤中的populations，LN 中的大多数 TRP-2 四聚体结合细胞表现出 CD103+CD69+CD62L- Trm 表型。为了更广泛地识别 RLN 中肿瘤特异性 Trm 细胞的存在，进行了 scRNA-seq。并行 scTCR-seq 能够将 LN 中的克隆与受白癜风影响的皮肤中的克隆匹配，作为参考组织，该组织被黑色素细胞/黑色素瘤 Ag 特异性 T 细胞浸润。转录聚类显示 LN 中有 7 个cluster，其中一个 (LN_6) 表达 Trm 细胞标记，包括 Itgae、Cd69 和 Cxcr6，但缺乏 Tcirm 标记。在受白癜风影响的皮肤中鉴定的 20 种最广泛的克隆型中，8 种与 LN 匹配，并且在皮肤中具有匹配的 LN 克隆型几乎完全映射到 LN Trm cluster。总之，这些结果表明内源性肿瘤特异性 CD8+ T 细胞在肿瘤引流 LN 中形成了 Trm 反应。
LN Trm cells mediate long-lived immunity to melanoma in RLNs
白癜风与转移性黑色素瘤患者的持久免疫治疗反应和良好预后密切相关。因此，患有 MAV 的小鼠在真皮和肺中维持针对黑色素瘤再攻击的长期保护性免疫。为了确定该模型中保护性记忆的完整程度，在原发肿瘤切除后至少 30 天，通过多种途径进行 B16 黑色素瘤再激发。为了仅评估宿主内源性免疫，这些再攻击研究中未使用 pmel 细胞。除了表现出强大的 CD8+ T 细胞介导的对尾静脉再攻击的保护作用，尾静脉再攻击会在肺中产生类似转移的疾病，MAV 小鼠还通过门静脉途径获得显著保护，防止再攻击，门静脉途径在肝脏中播种黑色素瘤。此外，还针对在先前肿瘤生长部位直接注入 RLN 中的黑色素瘤细胞提供保护。与肺部一样，LN 中的肿瘤保护是由 CD8+ T 细胞介导的，并且在接种多达 50,000 个 B16 细胞后观察到。因此，携带 MAV 的小鼠在内脏器官和 RLN 内持续对黑色素瘤提供广泛的保护。
考虑到发现肺和 LN 都含有异质性的 Trm 和 Tcirm 细胞群，目前尚不清楚这些细胞群中的哪一个在每个位置介导了长寿命的保护性免疫。为了解决这个问题，将带有 MAV 的小鼠与幼稚的受体共生化，以使 Tcirm 平衡 14 天。然后在同一天通过手术将小鼠分开并单独重新攻击，通过尾静脉或直接进入 RLN 中的 B16 细胞。再次尝试后共生化供体和受体小鼠的肺对静脉注射表现出类似的抵抗力，说明 Tcirm 细胞足以针对肺部转移样疾病的保护性免疫。这也说明保护性 Tcirm populations可以有效地转移到没有白斑的受体。无论如何，在共生受体小鼠中不存在对 LN 再攻击的保护，这表明 RLN 中的肿瘤保护需要 Trm 细胞。因此，Tcirm 和 Trm 细胞共同为转移部位的黑色素瘤提供保护，LN Trm 细胞为 RLN 内的黑色素瘤生长提供了屏障。
为了将这些发现扩展到人类，使用显微镜和转录谱分析了黑色素瘤患者的 RLN 中 Trm 样细胞的存在。 在人黑色素瘤浸润的前哨淋巴结 (SLN) 中观察到 CD8+CD69+ T 细胞。它们存在于 LN 实质和转移性肿瘤块中，但集中在转移瘤与其周围 LN 之间的边界处。 在转移灶直径 > 2mm 的 4 个 SLN 中的 4 个中观察到这些细胞，表明黑色素瘤患者 SLN 中 Trm 反应的自然产生。 免疫荧光染色进一步证实了黑色素主要涉及的 LN 中丰富的 CD8+CD103+CD69+TRM populations。
为了明确确定人类中 LN Trm populations的存在，对来自转移性疾病患者手术收获的黑色素主要参与的 LN 的 T 细胞进行了 scRNA-seq 和配对 scTCR-seq。 对分选的人类 CD8+ T 细胞的分析揭示了四个转录cluster，其中一个 (HuLN_1) 表现出 Trm 细胞的显著特征。 此外，该样本中扩增最多的前五个克隆型富集在 Trm cluster中，表明这些人 LN Trm 细胞已经进行了克隆扩增。 这些结果共同证实了患者中 LN Trm populations的存在。
研究 LN Trm 细胞在转移性黑色素瘤患者中的潜在预后意义，基于 pmel LN Trm cluster中相对于其他人群表达差异最大的基因产生了转录特征。生成皮肤-Trm 和肺-TCIRCM 特征用于比较。然后使用这些特征来推断来自癌症基因组图谱 (TCGA) 的黑色素瘤样本中记忆性 T 细胞的富集。评估 TCGA 中的所有黑色素瘤样本，所有三个特征都具有显著的预后价值。然而，当仅分析 RLN 转移性黑色素瘤标本时，LN-Trm 特征的富集提供了最强的预后益处，LN-Trmhi 患者的中位总生存期比具有其他特征的队列长至少 670 天。这种相关性在两个独立的黑色素瘤 RLN 转移数据集中得到证实，即使从特征中排除 CD8+ T 细胞特异性基因（Cd8a、Cd8b1、Cd3g、Cd3e 和 Trav7-4）也没有改变。此外，通过 Cox 多变量分析，LN Trm 特征的富集是转移性黑色素瘤标本中唯一重要的保护特征。因此，Trm populations存在于黑色素瘤浸润的 LN 中，它们的转录特征独特地预测了患者的更好结果。
DISCUSSION
产生持久的宿主范围抗癌免疫是该领域的基本目标。 最近对患者进行免疫治疗的成功表明，这种结果是可能的，但癌症会转移到不同的组织位置，并且 T 细胞必须能够进入、占据并在这些环境中发挥作用。 本研究为支持这些功能的 T 细胞多样性提供了新的见解。 通过产生循环和组织驻留记忆subsets，克隆相同的 CD8+ T 细胞群形成一个巨大的网络，赋予整个宿主保护性免疫。 分析阐明了引流 LN 内肿瘤排斥的鲜为人知的现象，我们表明 Trm 细胞是早期转移的这个关键部位肿瘤免疫的主要介质。
我们的研究证明了结合表型分析、转录组学和体内功能分析的关键价值，以揭示离散记忆 T 细胞亚群的身份。只有通过联体共生、流式细胞术和单细胞 RNA-seq 的组合，我们才能确定和有效地辨别记忆 T 细胞亚群的特性。尽管之前人们认识到 Trm 细胞根据组织位置采用独特的特征，但我们的研究揭示了这些精确的变化，并表明它们可以由肿瘤特异性 T 细胞的克隆群产生。单细胞转录组学揭示了宿主范围内抗肿瘤反应的异质性。肿瘤特异性 Trm 细胞在 LN 中形成了一个离散的记忆群，具有独特的转录特性。这些特性具有预后意义，例如它们具有预测具有 RLN 转移的黑色素瘤患者生存的卓越能力。由于先前对 LN Trm 反应的研究仅限于病毒感染的环境，我们在这里的工作显示了这种现象在肿瘤免疫和自身免疫中的重要方面。除了它们的 CD69+CD62Llo 表型外，肿瘤特异性 LN Trm 细胞在高 Itga1 和 Xcl1 和低 Sell、S1pr1、Klf2 和 Nr4a1 的表达方面与病毒特异性 LN Trm 相似。 LN Trm population也由高 Itgae 和 Cxcr6 表达定义，这在 Beura 等人中未观察到。阿尔。但在来自 HIV 患者的 CD69+ LN Trm 细胞中很突出。
皮肤中克隆相同的 Trm 细胞与皮肤引流 LN 之间的关系仍有待辨别。虽然与皮肤 Trm 细胞共享许多特征，但 LN Trm 细胞缺乏 AP-1 家族、Nr4a 家族和 Fabp4/5 转录本的表达。相反，它们表达了高水平的 IL-7R（已知它支持记忆性 T 细胞维持）和 1 型 IFN 信号的标记物，后者可以通过增加 CD69 的表达来促进组织驻留。作者之前的研究表明，LN 和皮肤中的记忆 T 细胞维持具有不同的特性，因为后者需要 CD103 表达，而前者不需要。无论如何，目前的研究不排除 LN 和皮肤compartments之间通过逆行迁移的潜在通信，众所周知，逆行迁移在病毒感染模型中维持 LN Trm 种群。虽然我们没有观察到 LN Trm 细胞在结合 30 天后达到平衡，但在自身免疫过程中可能会在几个月内通过淋巴管实现更渐进的平衡。此外，LN Trm 细胞与 LN 中的小群 CD103-Tcirm 细胞共存，后者不产生 IFNg，并表现出更类似干细胞或祖细胞耗尽的状态。更好地了解 LN 和皮肤中这些肿瘤特异性区室之间的关系应该更好地了解我们对区域抗肿瘤免疫的理解。
根据先前的工作查看目前的研究，肿瘤抗原的性质可能是 LN Trm 生成的重要因素。我们之前表明 MAV 是形成针对 LN 中共享黑色素瘤/黑色素细胞抗原的记忆所必需的。虽然之前的工作没有根据 Trm 标记区分 LN population，但我们现在认识到这些依赖白斑的population是 Trm 细胞。相比之下，针对 B16 表达的 OVA（一种模型肿瘤特异性抗原）的 T 细胞在 LN 中发育成常规的 CD62Lhi 记忆 T 细胞。黑色素细胞抗原被 MAV 小鼠 LN 中的 T 细胞持续感知，并且可以维持 LN Trm 种群。 LN Trm population可能反过来使自身免疫性白癜风持续存在，尽管这仍有待探索。尽管慢性抗原暴露，CD8+ T 细胞可以抵抗自身免疫的衰竭。人们可能推测抗原指导 Trm 细胞在 LN 内的定位，因为 pmel Trm 细胞聚集在 SCS 中，其中抗原由 APC 交叉呈递。值得注意的是，肿瘤抗原交叉呈递和早期转移性侵袭都发生在 SCS 内。将需要涉及自发转移小鼠模型的研究来证明 Trm 细胞可防止真正转移到 SCS。然而，我们发现 Trm 细胞驻留在这个空间表明它们在战略上定位这样做。
我们对初始抗原接触位点远端器官中持久黑色素瘤保护的鉴定改进和扩展了肿瘤特异性记忆 T 细胞反应作为组织受限的概念。 与 LN 相比，肺中的肿瘤保护是由该组织中的 Tcirm 细胞群介导的。 肺黑色素瘤保护中对 Tcirm 细胞的要求可能反映了肿瘤细胞引入该器官的机制，这是通过 Tcirm 细胞更普遍的静脉途径发生的。 由于肺 Trm 细胞通常占据气道，因此它们可能更适合针对原发性肺癌的免疫。 联体共生与门静脉注射手术相结合的技术挑战排除了我们对肝脏中这种现象的研究，尽管我们可以推测 Tcirm population广泛介导了针对黑色素瘤转移到内脏器官的免疫。
In conclusion, the present studies reveal the tissue-wide diversity of anti-tumor memory T cells, while highlighting a novel population of protective Trm cells within LNs. This work adds to a growing body of literature supporting a role for Trm cells in cancer immunity while filling a long-standing void in our understanding of tumor rejection within LNs. We propose that the installation of memory T cells across lymphoid and peripheral tissues will be a critical path to achieving curative cancer immunity.
Methods（关注一些重点方法）
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