易基因 | ACE-Seq：羟甲基化检测简介

DNA序列中胞嘧啶（C）5’ 碳位结合一个甲基基团而转变成5mC的现象称为DNA基甲基化。在5mC去甲基化的过程中，其会被氧化成5hmC，这种新的修饰称为DNA羟甲基化。

因为5hmC是5mC去甲基化的中间产物，所以对于多细胞来说，同一个C位点上不同细胞往往会存在5mC或5hmC不同修饰，而5mC与5hmC对基因表达的调控作用又完全不同：启动子区的DNA甲基化对基因表达的有抑制作用，DNA羟甲基化则会促进基因的表达。因此，对5mC及5hmC的水平进行精确地定量并分别研究十分有必要。

ACE-seq是一种全新的检测DNA羟甲基化的技术，由美国宾夕法尼亚大学Emily K Schutsky等在2018年发表在Nature Biotechnology杂志上。不同于传统的BS-Seq，该技术使用AID/APOBEC家族DNA脱氨酶APOBEC3A (A3A)代替化学脱氨，保证了DNA的完整性。A3A能够特异地脱去C及5mC的氨基使其变为U，而5hmC则因为不被该酶识别，测序时仍被检测为C。这样，便将5hmC与C及5mC区分开来。该技术原理示意图如下：

首先，利用T4 β-葡糖基转移酶（βGT）将5hmC转化成5ghmC，5ghmC不会被A3A酶脱氨基；然后，利用A3A酶特异去除C和5mC的氨基，使其转变成U，而5hmC保持为C，从而将5hmC和C/5mC区分开来。

ACE-Seq具有以下优势：

（1）检测范围为全基因组，可以得到基因组上大部分C位点的羟甲基化水平。

（2）单碱基分辨率。能够检测单个C碱基的羟甲基化水平，精确度高。

（3）低起始量。ACE-Seq利用脱氨酶实现5hmC与C及5mC的区分，反应条件温和，不破坏基因组，大大减少基因组DNA的损失，因此起始DNA量比常规的oxBS技术降低100倍。

（4）高准确性。绝大部分甲基化修饰的C都被转化成U，而绝大部分经过糖基化修饰的5hmC（5ghmC）则保持为C，表明该技术具有充分的可靠性。如下图：

（5）经济性。仅需一个文库解决问题，羟甲基化研究成本大大降低。 ACE-Seq独有的优势使其在羟甲基化检测领域拥有巨大的潜力。

为了让大家全面理解掌握自己究竟该选择哪种羟甲基化研究技术，我们再来温习一下oxWGBS-Seq。该技术将传统的BS-Seq技术与化学氧化相结合，先利用高钌酸钾将DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亚硫酸盐处理，5fC和没有任何修饰的C就被转化成U，而5mC则不会被转化，仍然保持为C。原理示意图如下：

该技术需要构建两个文库，图中蓝色虚线标出的为BS文库，紫色虚线标出的为OXBS文库。利用BS文库可以得到5mC和5hmC总的水平，利用OXBS文库可以得到精确的5mC的水平，两个文库相减，即可得到精确的5hmC的水平。根据该技术的原理可知，该技术可以同时得到精确的甲基化水平和羟甲基化水平。

oxWGBS具有以下优势：

（1）可以同时检测甲基化和羟甲基化的水平。

（2）检测范围为全基因组，可以得到基因组上大部分C位点的甲基化和羟甲基化水平。

（3）单碱基分辨率。能够检测单个C碱基的甲基化和羟甲基化水平，精确度高。

由于以上优点，oxWGBS被称为精准甲基化和羟甲基化检测的“金标准”。

根据oxWGBS还可以衍生出oxRRBS技术。oxRRBS是简化代表性重亚硫酸盐测序（RRBS-Seq）技术与化学氧化技术的结合，可以针对基因组上CpG含量高的区域（如CGI，启动子等重要的调控区域）进行甲基化及羟甲基化水平检测。由于oxRRBS只针对CpG含量高的区域进行检测，而这些区域往往是重要的调控区域，使得oxRRBS技术能够以较低的成本检测关键基因组区域的甲基化及羟甲基化水平。

然而以上两种技术有两个共同的缺点。首先，由于重亚硫酸盐处理对DNA有强烈的破坏作用，导致建库过程中会损失大量DNA，因此该技术需要的DNA起始量较高；另外，由于该技术需要构建两个文库，会导致成本的上升。

此外，还可以利用hMeDIP-Seq技术来检测DNA羟甲基化。hMeDIP利用5hmC特异性抗体富集基因组上发生羟甲基化的DNA片段，结合高通量测序，检测基因组上羟甲基化的区域。原理示意图如下：

 该技术针对羟甲基化的片段进行测序和定量，成本大大降低。但该技术无法达到单碱基分辨率，也无法得到精确的羟甲基化率，只能得到羟甲基化修饰的信号强度。