细胞水平基因干扰主要方法有哪些？

目前在细胞水平做基因干扰主要有三种方式：siRNA、shRNA质粒和shRNA病毒。

其实三种干扰形式最终发挥作用的形式都是siRNA，而后两种都需要用启动子将sh的序列转录成siRNA再去发挥基因干扰的作用。

siRNA是通过化学合成的方法直接合成，通过通过转染试剂或者电转直接将siRNA转染进入细胞内发挥作用。

shRNA质粒是以质粒的形式通过转染试剂或者电转将质粒转染细胞，质粒进入细胞后通过U6等相关的启动子启动sh的转录，转录为siRNA的形式发挥作用。

shRNA病毒是将含有sh序列的质粒包装进入相应的病毒（常用的有慢病毒、腺病毒、腺相关病毒）中，用病毒感染目的细胞，病毒进入目的细胞后sh质粒通过启动子启动sh的转录，转录为siRNA发挥作用。

下边是之前整理的三种形式的优缺点

1．siRNA

随着化学合成的siRNA的价格降低，化学合成的siRNA已经成为目前应用最为广泛的形式。

优点：其具有短平快的有优点，发挥作用时间短，价格低，转染操作简单。由于其本身片段只有21bp左右其相对于质粒形式的shRNA来说转染更容易，转染效率更高，对于一些难转染的细胞来时是不错的选择。一般建议转染后24-48小时进行mRNA水平的检测，48-72小时进行蛋白水平的检测。

缺点：由于其自身为化学合成的RNA，其具有正常RNA的特性，也容易降解，作用时间比较短，有时候会存在效果不是非常稳定的情况。不能进行真核抗生素的筛选。

2.shRNA质粒

shRNA 为以质粒形式的存在的RNAi类别，其通常含有一段目的基因的靶序列以及把该靶序列的正义和反义链连接起来的loop环。常用的启动子有U6和H1。

优点：shRNA具有所有质粒都有的特点，可以人为的添加GFP等荧光标签，添加puro等真核筛选标签，便于实验中观察细胞的转染效率，如果转染效率达不到要求还可以选择对应的真核抗生素进行筛选。

有很小的概率可以整合基因组形成稳定的表达。可以通过原核系统进行扩增，如果是长期使用的靶点可以降低成本。作用时间比siRNA时间更长一些。由于其需要通过启动子启动siRNA的表达所以相应的检测时间要比siRNA略晚。

缺点：由于shRNA是以质粒的形式存在，所以对于难转染的细胞来其实验难度就大大提高。基本不能形成稳定干扰的细胞系。

3. shRNA病毒

优点：其具有shRNA的所有特点，shRNA包装成病毒的形式进行转染细胞，转染效率有相应的提高，如果是慢病毒形式的shRNA还可以整合到目的细胞的基因组中形成稳定干扰的细胞系。其具体的检测时间需要根据不同的病毒类型做相应的调整。

缺点：病毒包装周期较长，包装病毒成本相应增高。