光片显微镜与传统显微镜的不同在于激发光的照明方式。它的照明光是一张与成像面平行的薄薄的“光片”(图3)，只有焦平面的样品被照亮，而其上下的样品不受影响。
和传统荧光照明方式相比，光片照明有如下优点：
提高了图像和背景的反差(Signal-to-Background Ratio) 和轴向分辨率：光片照明技术保证了焦平面上下的样品不会被激发，具备和共聚焦显微镜类似的光学切片功能；
减少了光漂白和光毒性：与传统的荧光照明技术相比，光毒性可以被降低20-100倍，这样，我们就能在更接近生理状态的条件下，对活体生物样品进行长时间的三维成像；
与激光共聚焦和双光子显微镜使用低QE的PMT的点扫描成像相比，光片显微镜使用高QE的CCD或sCMOS相机进行面成像，大大提高了成像速度和图像的信噪比。共聚焦需要几分钟甚至几小时才能拍完的样品，用光片显微镜只需要几秒到几分钟。因此，光片显微镜也特别适合用于大样品成像。
在多数光片系统中，光学元件是固定的，需要移动样品 (或使光片从xyz方向扫过样品) 来获得完整的3D图像。通过移动或旋转样品，可以对大样品进行成像，并从多个角度拍摄，将这些多视角图像通过特别算法融合在一起后，能够进一步提高图像分辨率，并修正一些光片技术特有的缺陷。
总之，光片荧光显微镜从设计原理上，大大降低了激发光对活体样品的光毒性和光漂白，天生具有光学切片能力，使用高量子效率的CCD或sCMOS探测器，是大视野，高速，高分辨率三维活体显微成像的理想工具
产生光片最简单的方法是在光路中引入一个圆柱形透镜。通过该透镜的光，宽度维持不变，但在高度上被压缩成平面 (图4)，然后通过照明物镜，在焦面上形成“光片”。成像物镜垂直于照明物镜放置，并聚焦在光片上获取荧光信号。
使用NA较小的照明物镜，能够实现较宽范围的均匀照明，即视野更大；但是相应的，光片的厚度也越大，导致轴向分辨率降低。而高NA物镜产生的光片视野会比较小，但轴向分辨率较好。