2022-09-06

Nat Biotech | 中科院杨辉组通过靶向RNA降解的高保真Cas13变体降低副作用

原创 图灵基因 图灵基因 2022-09-06 10:10 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学机制

CRISPR–Cas13——一种2类VI型RNA核酸内切酶，具有两个高等真核生物和原核生物核苷酸结合（HEPN）结构域，用于RNA切割——靶向并降解RNA。RNA靶向已广泛用于酵母、植物、果蝇、斑马鱼和哺乳动物中的RNA切割。它还被用于检测核酸存在的分析。

现在，研究人员开发了一种快速灵敏的双荧光报告系统，可以检测附带效应。在此过程中，他们发现Cas13可以在HEK293T细胞中诱导大量的附带效应。此外，他们使用该系统测试了新设计的变体，发现了显著减少脱靶效应的高保真Cas13（hfCas13）变体。

这项研究发表在《Nature Biotechnology》上的一篇题为“High-fidelity Cas13 variants for targeted RNA degradation with minimal collateral effects”的论文中，证明了hfCas13在哺乳动物细胞和动物中几乎没有副作用的情况下有效降解靶向RNA的可行性。

人们对Cas13的脱靶效应提出了担忧。先前的结构研究表明，当Cas13与靶向RNA结合时，两个HEPN核酸酶结构域可能会在蛋白质表面形成催化位点，因此除了靶向RNA的靶向切割外，还可能产生旁观者RNA的混杂切割。

由于这种附带效应，Cas13可能会随机降解靶向RNA和非靶向RNA，因此难以设计实验和解释结果。

在这项研究中，研究人员设计了一种双荧光报告基因（EGFP和mCherry）质粒系统，来检测哺乳动物细胞中Cas13的附带效应。在该系统中，mCherry荧光细胞的丢失被解释为成功的靶向编辑；EGFP荧光细胞的丢失被解释为脱靶切割。在200多个工程变体中，一些Cas13变体（包括Cas13d和Cas13X）表现出有效的靶向活性，但附带活性显著降低。

然后，研究人员试图通过诱变来设计Cas13d（RfxCas13d，一种来自Ruminococcus flavefaciens XPD3002的Cas13d），并基于新的双荧光报告系统（包括含有EGFP、mCherry和EGFP靶向gRNA的单个质粒）筛选副作用最小的变体。

该团队设计并生成了一个Cas13d变异的诱变文库，并将其分别转染到HEK293细胞中。通过使用流式细胞术分析报告荧光，五种变体（N1V7、N2V7、N2V8、N3V7 和N15V4）显示出相对较低的EGFP+细胞百分比，以及较高的mCherry+细胞百分比，表明靶向活性较高，副作用活性降低。

变体N2V8是一种高保真Cas13d（hfCas13d），由于其对RNA降解的高度特异性，被用于进一步表征，包括使用RNA测序进行转录组范围的脱靶分析。当靶向几种内源性转录物（如PPIA）时，hfCas13d的脱靶基因数量显著减少。此外，hfCas13变体对细胞系、转基因动物和体细胞没有可检测到的附带损伤，因此支持其体内应用。

该团队于2021年发现了CRISPR-Cas13X系统，这是迄今为止已知的最小（只有775个氨基酸）RNA编辑工具。在他们的新研究中，由中国科学院神经科学研究所Yang Hui博士和HuiGene Therapeutics的研发团队领导的研究人员对Cas13X进行了进一步改造，并获得了hfCas13X变体，该变体在靶向RNA降解方面表现出高特异性，但副作用最小。hfCas13X在基于RNA编辑的基因治疗领域显示出巨大的应用潜力。本研究中鉴定的Cas13变体在未来的RNA编辑和治疗应用中可能会更加有用。