第 32 策 四通八达

不同分子类型的高阶文章如何构思复杂逻辑

DNA-mRNA-蛋白 或DNA-ncRNA( miRNA/LncRNA) 直接发挥调控作用

miRNA

miRNA+靶基因之上再增加变量，在靶基因下游增加一个与表型关系已有报道的 明星效应分子。如果中间这个靶基因是有创新的变量，下游串联明星分子自圆其说， 则靶基因与下游变量的调控关系，或者其与表型的逻辑关联都需要论证，可增加工作 量为文章加分。

miRNA+靶基因的下游嫁接间接机制即可，因为不是包含主变量的二元关系，不要把 戏份搞得太复杂。 miRNA 的上游，是另一组涉及主变量的二元关系，依然可设计直接机制细节结构，其 中典型的还是转录调节模式。

miRNA 的启动子找上游转录因子与其他分子类型并 无特别的差异，按照套路规范化展开。因为 miRNA 序列短，DNA 水平的变化概率 小。它又不编码蛋白，没有翻译水平的腾挪空间，所以聚焦于转录水平的调控是不二选择。

转录因子+miRNA+靶基因+效应明星分子的四元两组直接分子交互的高阶构造。

lncRNA机制：分为基于 RNA 交互的 ceRNA 机制，与蛋白产生交互的 2 种直接机制模式。

以 lncRNA+蛋白的一组直接交互为核心要件，可在下游链接该结合蛋白已知的一套调 控机制，简单的做法是验证间接作用关系，但是如果结合蛋白能够参与调节分子修 饰，可变剪切等分子形变的过程，下游机制也可展现出非常复杂的内容，直接交互基 础上再形成横纵嵌套的结构，驰骋于高分 SCI 的领域。

转录因子这一类的直接机制上游框架效果百搭，套用上去并无违和感，如果在转录后 水平的 RNA 修饰加工上挖掘故事，则创新感受就更卓了。上游组合一个间接作用的分子变量，描述一种场景状态（比如缺氧诱导因子 HIF-1），也是性价比不错的加分思 路——实验环节不难，场景细节增加文章层次。

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功能蛋白

其从基因水平，转录水平、转录后 水平，翻译水平和翻译后水平均可产生变化
第一层关卡是锁定分子和表型的创新逻辑联系，这其中筛、猜和验证的手段，局限在 单变量论证的套路规范里。
功能蛋白的创新主变量介导表型，获得这第一步的关键结论之后，常规的高阶做 法是直接进行蛋白-蛋白交互作用的筛选，用 20 策“左右逢源”讲授过的 pulldown，IP+质谱等技术，找到存在结合作用的靶蛋白，然后根据靶蛋白介导 的已知功能和调控机制，再设计下一步延伸更多变量嵌套或者横纵展开的潜在模式。立足于发高分时，先直接再间接，更容易生产出自洽的多维嵌套逻辑。

主变量验证完表型之后，尝试高阶的多维嵌套机制结构，其破解的关键步骤是在 难的二元分子交互部分。因此研究的流程顺序，往往并不是做完了间接调控的 变量要素串联，再来探究局部的直接机制细节，而是先把直接机制的二元交互确 认之后，再从交互的二元变量延伸出上下游的间接机制要素，概言之，采取先难 后易的解决思路。

第二层关卡是根据已有的主变量分子筛猜机制因变量，这其中路径众多，走通一条即 成一篇文章。
第三层关卡是在细节方向上，详细解析一组直接机制的原创交互关系。

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细胞交互

细胞交互的表型现象，一般优先于变量的筛选步骤。
是先有供体细胞培养上清刺激受 体细胞产生表型的改变，再有进一步解析具体参与交互的分子变量到底是谁。选择分 泌因子还是囊泡运输，也基于课题设计者的主观喜好。
什么类型的两种细胞发生交 互，以及通过什么途径交互，是构思中预先埋设的参数。在这样的套路框架中，把间 接机制和直接机制的多变量完整变化代入，就形成了至高无上的逻辑顶配数据格式。 基于细胞交互的研究设计，起点在 5 分以上的 SCI 水平，低分灌水阶段没有必要舍近 求远。
供体细胞上游+主变量，受体细胞主变量+直接靶点+明星下游，这样的一组逻辑关 系，能将 4 个变量（2 组间接 1 组直接）处理得十分妥帖。细胞交互中经常涉及的变 量还有受体细胞膜上接受信号的特异性受体，哪怕只是验证已有报道的明星分子，也 能令信号传导的链条更加的完整。在受体细胞接受信号的方式上，直接无差别摄取或 者经由膜上识别模块靶向性激活，后者能够至少增加一组变量直接交互关系，是颇有份量的机制挖掘增补工作。

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8 个 figures

【主变量-表型】
Figure 1：论证主变量的组织表达差异，提示与临床因素的相关性。这部分结果也可放在文 章的后一个图，但是揭开作用机制之后再验证表达差异，往往需要在主变量基础上增加 关键因变量的共表达模式分析。
Figure 2，3：论证主变量一正一反操作之后的表型变化，因为有细胞和动物两个维度的数 据可以做，一般由两个图组成。也可以把过表达的体外、体内结果放在一个图上，反向沉 默策略再来一个图。多株细胞多个检测方法的叠加都能体现出数据工作量。

【主变量-主线机制】
Figure 4：论证下游机制，大概率是从变量的调控关系开始入手，可以筛、猜，将效应环节 的明星变量找到，建立与表型在逻辑上的自圆其说。在这一部分，通常还会进行 Rescue 验证，将效应分子节点的必要性阐释清楚。
Figure 5：论证一组分子交互作用，提出新的直接机制因变量，按照数据规范套路完成两个 平行实验的结合验证以及分段突变验证结合位点。这组直接交互如果能够有助于理解 Figure 4 的关键效应分子变化原因，则逻辑效果是理想的。
Figure 6：论证上游机制，或者转到横纵嵌套，通过增加新变量，增加机制的层次感。考虑 提升难度壁垒的话，在此加入直接机制的模块；如已经不堪负担，则用明星分子的间接机 制，以调控关系和 Rescue 验证交代完信号传递的上下游后结束。
Figure 7：将上述细胞水平论证的多元变量调控关系以及交互作用，在动物模型上进行双重 验证。

【第三部分：因变量-支线机制】
Figure 8：在多元变量中选做一组不包含主变量，但是有一定创新价值或者对于信号传递具 有至关重要的一种分子机制。如果是细胞交互的设计，既可以阻断分子，也可以阻断分泌，甚至可以阻断吸收，多点操控至少增加一个 Figure 的数据内容。主线机制论证的数据 也可以放在动物水平、组织水平上表现，相对而言，比机制上进行支线论证要容易驾驭得 多。

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