作者：biogevin
审稿：童蒙
编辑：amethyst

我们在前面已经介绍过膀胱细胞的相关背景（认识膀胱细胞——单细胞水平比较Human和Mouse的不同）以及膀胱癌的恶性影响，而今天这篇文章，则对膀胱癌做了进一步的挖掘。该文章中研究思路、分析方法都是值得学习和参考的，用到的生信工具也是比较常见和经典的，可以辅助肿瘤单细胞项目的研究更加清晰。

一、材料和方法

01.样本信息及单细胞测序

样本：8例原发性膀胱肿瘤样本（其中2例轻度，6例高度）以及3个配对的癌旁样本。

文库制备及10X单细胞测序：通过10X微流控制备系统实现单细胞文库制备，再通过HiSeq X Ten平台进行测序。

02.原始数据处理和质控

CellRanger (2.2.0) 进行前期数据处理工作，Seurat (3.0.0) 对前面获得的表达量矩阵进行过滤。

过滤掉UMI数小于1000的细胞
过滤掉线粒体来源的UMI计数超过10％的劣质细胞
为了消除双细胞影响，过滤掉表达高于6000个基因的细胞

最终，获得52721个细胞用于下游分析。

去除批次效应时，使用Seurat的FindIntegrationAnchors函数利用top 3000基因作为潜在锚点，用于样本整合时批次效应的消除。

二、研究结果

01.细胞类型鉴定

通过对52721个细胞降维聚类分析，划分为8个亚群。利用亚群特异性的marker来注释细胞类型：

epithelial（EPCAM+）；endothelial（CD31+）；
两类fibroblasts（COL1A1+）：iCAF（PDGFRA+）和mCAFs（RGS5+）；
B cell（CD79A+）；myeloid（LYZ +）；T cell（CD3D +）；mast cell（TPSAB1+）

02.肿瘤细胞的高度异质性

01.亚群的细分
将EPCAM+上皮细胞进行亚群细分，重新划分为17个亚群。尽管数据处理中进行了样本间批次效应的去除，但在上皮亚群细分仍发现亚群的分布存在样本特异性。

02.从CNV水平对亚群进行细分
使用单细胞的数据，利用InferCNV的方法发现CNV水平与肿瘤恶性程度存在相关性，CNV主要存在于恶性程度更高的肿瘤细胞中。作者依据CNV水平将上皮细胞划分为四类：low, high, control, and undetected。

03.不同CNV水平细胞类群的差异
为了检测不同CNV水平细胞类群的差异，作者进行不同CNV水平基因表达聚类分析。

在control和undetected两个类别中发现一簇基因特性表达，而功能分析表明该类基因与免疫相关，尤其是B细胞途径。通过MHC-II 分子和CD74的表达和免疫荧光实验，发现相较于正常上皮细胞，癌细胞几乎丧失了产生免疫球蛋白的能力，其表达的MHC-II分子水平更低，揭示癌细胞可能通过下调免疫原性获得免疫逃逸。
high CNV水平细胞表达更高的IGF2，导致不良预后。此外，GSVA分析表明high CNV水平细胞在E2F targets、MYC targets和G2M checkpoint pathway存在显著上调，而 immune-related pathways下调。以上结果表明了恶性肿瘤细胞免疫原性的降低以及增殖能力的提高。

03.Myeloid细胞的亚群细分及特征分析
Myeloid细胞的亚群细分后获得7种亚细胞类型并通过实验验证：

TAMs（MRC1+C1high）
CD1C+ DCs（CD1C+CLEC10A+）
monocytes (S100A8+S100A9+)
proliferating myeloid cells(TOP2A+)
cross-presenting DCs (CLEC9A+)
follicular B cells (CD79A+MS4A1+)
LAMP3+ DCs (LAMP3+CCR7+)

01.对monocyte进行分析
monocytes主要来源于癌旁细胞，而TAMs主要富集于肿瘤区域，通过两类细胞的基因表达模式的聚类分析，发现

二者的表达谱呈连续型变化，暗示募集到肿瘤区域的monocytes被重编程为TAMs；
拟时间分析和RNA速率分析也都证实了由monocytes到TAMs的变化趋势。

SCENIC分析发现BACH1，MAFG和NFE2这三个基因的活性随着拟时间轨迹被抑制，而MAF，STAT1和STAT2基因被激活，揭示了单核细胞M2极化的原因。

02.对DCs进行分析

在LAMP3+ DCs中多种码编码细胞因子的基因高表达，参考前人研究结果，CCL17和CCL22通过与Tregs膜上表达的CCR4结合，对Tregs具有较强的趋化性。作者也通过LAMP3+DC信号与CCR4+的Treg信号以及Th2信号高度正相关关系，以及LAMP3 + DCs显示出最高水平的CD274，得出结论：LAMP3+DCs可以直接抑制CD8 + T细胞或通过募集Tregs进入肿瘤区域，获得免疫逃逸。

04.Fibroblasts细胞的亚群细分及特征分析
Fibroblasts细胞的亚群细分后获得8个亚群。作者依据两种marker将成纤维细胞亚群划分为两类：

myo-cancer-associated fibroblasts (mCAFs, RGS5+)
inflammatory cancer-associated fibroblasts (iCAFs, PDGFRA+)

为了研究两种成纤维细胞亚群的特征，作者进行了GO富集分析。

iCAFs在细胞外基质组织、细胞迁移以及血管生成条目存在显著富集，暗示了iCAFs可能与肿瘤转移、增殖相关。
mCAFs在肌肉系统过程、肌肉收缩过程中存在显著富集。

作者也进行了GSEA分析，结果表明：

iCAFs在细胞外基质降解、细胞因子-细胞因子受体互作途径存在显著富集，
mCAFs在肌肉收缩和PGC1A途径富集。

05.iCAFs功能分析
作者利用细胞通讯（CellphoneDB2）、SCENIC以及公共数据库来进行iCAFs的功能分析。

通过细胞通讯分析发现，iCAFs中特异性高表达CXCL12配体，而前人研究CXCL12-CXCR4配体受体对与TAMs的积累有关。作者通过对CXCL12的表达水平与肿瘤浸润巨噬细胞信号（CD163）进行相关性分析，发现二者显著正相关。同时，生存曲线表明高水平的CXCL12与不良预后显著相关。以上揭示了iCAFs在调节膀胱癌免疫浸润状态发挥作用。
通过SCENIC分析，mCAFs中特异性激活MEF2D和MEF2C，其肌肉谱系的转录调控中具有重要作用，而iCAFs中特异性激活TCF21和TWIST2基序。在先前的研究中，TCF21与冠心病有关，TWIST2是上皮细胞-间充质细胞转化（EMT）的驱动因子。但是二者在iCAFs中的功能仍需进一步研究。
在结果4的GO富集分析中发现iCAFs具有生长因子活性，为了验证其增殖作用，作者分析了肿瘤微环境中VEGF，FGF和IGF家族的表达水平，发现iCAFs是各种生长因子的主要来源。IGF1是iCAFs中特异的生长因子，生存曲线其与不良预后显著相关。而细胞体外培养也表明了iCAFs促肿瘤增殖的能力。

三、结论

通过对这篇文献的学习，我们了解到膀胱癌肿瘤微环境的复杂性以及不同细胞类型之间在肿瘤发生时的相互作用。该项单细胞研究从前期的样本制备、数据质控、细胞降维聚类、细胞类型鉴定，再到后期不同细胞类型亚群细分、细胞通讯、转录因子调控网络以及公共数据库的应用，让我们熟悉了单细胞分析的路程、应用的工具以及落实到基因的方法。

四、参考文献

Chen Z , Zhou L , Liu L , et al. Single-cell RNA sequencing highlights the role of inflammatory cancer-associated fibroblasts in bladder urothelial carcinoma[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):5077.

单细胞分析揭示iCAF亚群在膀胱癌治疗中的靶标作用