【文献解读】science-利用空间转录组学对组织切片中的基因表达进行可视化和分析

今天介绍空间转录组学的第一篇文章，来自瑞典卡罗林斯卡研究机构的开发的空间转录组学技术，这开创了一个很好的模式，为后边时空组学的发展带来了启示，为医学影像革命具有重要推动作用。

组织切片中蛋白质或信使rna (mRNAs)的模式分析是生物医学研究和诊断的基石。这通常涉及到一次显示几个蛋白质或表达基因。我们已经设计了一个策略，我们称之为空间转录组，它允许可视化和定量分析的转录组与空间分辨率在单个组织切片。通过在排列的逆转录引物上使用独特的条形码定位组织学切片，我们展示了高质量的rna测序数据，并保留了来自小鼠大脑和人类乳腺癌的二维位置信息。空间转录组学提供了定量的基因表达数据和组织切片中mRNA的可视化分布，使新型的生物信息学分析成为可能，对研究和诊断有价值。

组织转录组通常是通过均一组织切片的RNA测序(RNA-seq)来研究的，这会导致平均转录组和空间信息的丢失。基因表达的位置背景对理解组织功能和病理变化至关重要。目前已经开发出了几种策略与这一目标,但它们有局限性的数量记录,可以分析,依靠丰富的现有数据集,和/或昂贵,劳动密集型的,没有一个是运行在标准的研究和诊断的常规组织学组织部分。我们询问是否有可能在rna测序前完整组织切片的互补DNA (cDNA)合成反应中引入位置分子条形码。我们首先评估了从表面组织切片中的信使RNA (mRNA)生成cDNA的可行性。我们将反转录oligo(dT)引物固定在玻片上，并将其置于成年小鼠嗅球切片上，嗅球是一个具有清晰组织学标志和丰富基因表达参考数据的脑区。组织固定、染色并成像。
在渗透后，我们在组织的顶部添加反转录试剂。我们使用荧光标记的核苷酸使合成的cDNA可视化。组织就开始删除,造成cDNA耦合arrayedoligonucleotides幻灯片。相对应的荧光cDNA详细显示模式的组织结构显示一般组织学(图1,B和C),和cDNAwas严格局部直属单个细胞(图1 D G)。通过比较hematoxylin-and-eosin和荧光信号,我们可以测量的平均距离扩散边界外的细胞1.7 - 2毫米(SD)(图S1, E H)。意识到可以捕获mRNA在组织部分以最小的扩散和维护位置表示动机我们寡核苷酸阵列位置条形码,我们表示这一战略空间转录组。在1007个特征中，每个特征沉积了约2亿个寡核苷酸，其直径为100 mm2，中心到中心的距离为200mm，面积为6.2 mmx6.6 mm。捕获和reverse-transcribingmRNA之后,我们生成的序列库基于放大通过体外转录。与RNA提取和数据分散在溶液中显示~ 95%的基因发现的方法还发现与其他(图S3C)。表面文库和溶液中文库之间的相关性r = 0.94，高表达或低表达的基因均能表达(图S3D)。相邻组织切片的表面实验重复显示r = 0.97的相关性(图S3E)。因此，与溶液方案相比，从表面排列寡核苷酸的组织合成cDNA是有效的，而且不会引入偏差(图S3F和表S1)。我们使用空间条形码将RNA-seq数据排序到对应的阵列特征，并将组织图像与阵列特征对齐，从而实现可视化和分析。基因表达模式的例子揭示了空间转录组和验证的原位杂交显示。S4, c .转录表达在非常低的水平,如嗅觉受体信使rna,也被发现与空间转录组(图S4D)。
每个个体特征的基(图2C)和独特转录本(图S5A)在不同细胞密度的细胞层之间有所不同(图2D和表S2)。对于绝大多数基因，变异系数随着平均表达量的增加而减小基因和转录的数量至少两倍当使用激光捕获显微解剖和空间转录组检测几乎两次考试的许多基因原位杂交在艾伦大脑图集。此外,我们比较空间转录组- 100%附近灵敏度的单分子荧光原位杂交在相邻的组织部分。空间转录组的灵敏度为6.9 1.5%的单分子荧光原位杂交。相比之下，单细胞RNA测序已被报道有大约5 - 40%的敏感性。为了进一步评估转录本可能的横向扩散，我们研究了10个高度富集表达的不同基因在中间细胞层(MCL)的表达分布。

我们询问是否可以在邻近的颗粒细胞层(GCL)中检测到它们。所有这些基因被证实由空间MCL中高度表达的转录组,但他们察觉或发现在GCL在非常低的水平,甚至是0到5毫米的边界特性和功能的中心50到55毫米的制程(图2、E和F和图S7A)。相比,此外,我们记录之间的分布与激光捕获显微解剖得到的区域没有扩散的成绩单和空间转录组的特性,我们没有发现证据表明这些方法之间的区别的mRNA扩散(S7, B和C)。组织的基因表达分析的一个共同的目标是定义特定区域的转录组。同源区域之间的分析显示非常相似的表达谱(图3,A和B，以及图S8)，没有差异基因表达。相比之下，不同结构域的比较显示了不同的基因表达谱(图3,A和C，以及图S8)。这包括先前已知表达受限的基因，如肾小球层(GL)中的Doc2g和GCL中的Penk，以及新的层特异性基因表达谱(图3C)。这是有价值的探索群体细胞或组织域的基因表达模式，可以确定的标记组合。空间转录组学提供了一种替代方法，绕过多重标记和细胞分离。一组基因存在或不存在表达的任何组合都可以用来定义感兴趣的标记谱，以供进一步分析。特征的选择是基于三个神经元间标记基因Camk4、Th和Vip的存在和/或缺失。其中一个基因单独表达的特征分布如图3所示。通过对基因表达的比较，我们发现了这些神经元间标记谱定义的特异性转录组(图3,E和F，以及图S8)。为了进一步探索嗅球内空间定义区域的基因表达谱，我们使用主成分分析(图S9)或t分布随机邻居嵌入(t-SNE)机器学习算法来降维，然后进行层次聚类(图4A)。当将聚类特征放到组织图像上时，可以明显地看到，每个聚类特征在很大程度上都对应于明确定义的形态层(图4B)。然后将这些聚类相互比较，从而可以识别和可视化聚类特异性标记基因(图S10, A和B)。这被证明是一种有效的、无偏见的方法来识别感兴趣的细胞层中表达丰富的基因。此外,我们调查了10部分的基因表达模式的五个动物,以及feature-to-feature相关性在相同的位置在两个相邻的部分。分析常规组织学和一组标记在癌症诊断,尽管面板的表达基因的分析已经开始进入诊所。我们的问题是，为基因表达分析增加空间维度是否可以增加癌症诊断的信息，并将空间转录组应用于乳腺癌活检。在图4中，C和D为浸润性导管肿瘤区域，以及六个独立的导管原位癌区域，是在形态学标准的基础上确定的。

侵袭性成分的空间转录组分析显示细胞外基质相关基因高表达(图4E)。对导管癌原位区域的分析显示，这些区域之间的基因表达惊人地高度异质性，可能反映了不同的亚克隆，与癌症进展有关的几个基因表达不同。例如，KRT17和GAS6与上皮细胞向间充质细胞转变有关，仅在1和5区域表达高(图4、C至E和图S11)。因此，空间转录组在活检中显示了意想不到的异质性，这是常规转录组分析无法检测到的，而这可能提供更详细的预后信息。与匀浆组织的RNA-seq分析相比，空间转录组只需要几个额外的步骤，因为它提供了空间信息，能够进行额外级别的分析。与标准方法不同，组织的不同区域在空间转录组学中以相同的反应处理，这消除了样本之间的技术差异。空间转录组学的一个独特特征是，任何基因表达谱都可以被选择来指定一个分子定义的区域进行进一步分析。最后，与将组织的不同区域进行解剖分析相比，保留了整个切片的信息;因此，分析并不局限于最初选择的区域。因此，个体空间转录组实验可以作为研究基因表达模式的永久资源。