文献学习012--[sc]心脏免疫细胞单细胞转录组分析揭示Rel驱动CD72阳性巨噬细胞诱导心肌损伤

目标：这个研究的目的是通过单细胞测序探究TAC小鼠心脏巨噬细胞的异质性，寻找与心脏损伤有关的巨噬细胞亚群。
方法和结果：作者从CD45⁺的单细胞测序数据中选择了所有的巨噬细胞，通过降维聚类和富集分析鉴定出了一类高度促炎的CD72^hi巨噬细胞。拟时序分析和ChIP-Seq分析发现Rel是诱导CD72^hi巨噬细胞分化的关键转录因子。Rel KD和Rel-/-骨髓嵌合小鼠施行TAC手术后心肌损伤减轻，细胞因子和ROS水平下降，心肌细胞死亡受到抑制。而对TAC小鼠进行Rel过表达的单核细胞和CD72^hi巨噬细胞注射则加重心脏损伤。在心梗中，CD72^hi巨噬细胞也可发挥促炎和介导心肌损伤的作用。此外，扩心病和缺血性心肌病引起的心衰患者存在CD72^hi巨噬细胞的上调。
总结：骨髓来源的，受Rel调控的CD72^hi巨噬细胞具有促炎功能，可以引起心肌损伤。因此或许可以作为多种心血管疾病的治疗靶点。

Graphical abstract里面Cardiomyocytes都拼错了是不是过分了点？

思路总结

涉及单细胞的主要还是前两个Fig，所以主要来看一下这个部分。

1. CD72^hi巨噬细胞和炎症表型呈正相关。

对5只TAC鼠和5只Sham鼠的心脏的免疫细胞进行了单细胞测序，质控得到8223(Sham)和5652(TAC)个细胞。其中绝大部分都是巨噬。

所以后续的分析是从所有细胞中提取了巨噬细胞，只对巨噬细胞进行了分析

A：再聚类得到8个细胞群。（这个图1看起来像是没有去除批次效应，TAC和SHAM的细胞完全分开，感觉是作者刻意为之，以便清晰将两组细胞区分开来。）
B：使用一个促炎基因集（包含25个促炎基因）对得到的8个群进行GSEA富集分析，cluster1 4 5和促炎基因集正相关。结合图A可以看到cluster4和5几乎都是TAC鼠心脏的巨噬细胞。
C：进行marker screen，筛选有意义的基因。对membrane protein sets (GO:0016020) 和cluster 4中高表达的基因取交集，得到42个基因。（不太理解为什么是这两个取交集？为啥抛开了cluster 5呢）
D：在42个基因中，CD72对cluster4和5具有最好的区分度。
这两个ROC曲线是用CD72来表征某种巨噬细胞，但是分群的时候，想要计算ROC的细胞群比如cluster4和5中有些细胞表达CD72，有些不表达，就是说有分错的时候。这个曲线，就是看看分群的准确性如何。也就是说，把表达CD72当成真实分群，然后算cluster4和5的ROC（⚠️这个思路有意思，后续研究一下画法）。（这部分是使用AUCell做的。）
E：CD72的水平和促炎因子Tnf, Il1b、趋化因子Ccl2, Ccl4和促纤维形成因子Tgfb1呈正相关。这张图是使用corrplot做的。

F：对CD72阳性的巨噬细胞进行功能富集，富集到了两条巨噬细胞相关通路：巨噬细胞趋化和巨噬细胞迁移
G：为了验证前面的结果，使用流式检测了两种心衰小鼠模型（TAC和AngII）心脏中巨噬细胞CD72的表达，结果都显示心衰小鼠心脏巨噬细胞表达CD72增加。
H：心衰小鼠的左心功能与巨噬细胞CD72的表达呈负相关。

2. Rel是驱动CD72^hi巨噬细胞数目增加的关键转录因子

A：为了探究CD72^hi巨噬细胞的来源，作者计算了CD72和巨噬细胞一些经典marker的相关性。结果显示Cd72和Ccr2有很好的相关性，提示CD72^hi巨噬细胞可能属于髓系来源的CCR2+巨噬细胞。
B：对所有单核和巨噬细胞进行monocle拟时序分析的结果显示在单核向巨噬的分化过程中，CD72表达增加。进一步验证了CD72^hi巨噬细胞是由单核分化而来的。
C：对与CD72高度正相关的基因、转录因子和差异基因（logFC>1）取了交集，得到2个与CD72高度正相关的差异表达转录因子Rel和Rbpj。（高度正相关的高度定义值没有给出，转录因子list也没有给出）
既往研究报道Rbpj是单核细胞向巨噬细胞分化的关键因子。（就这样排除掉了Rbpj对CD72^hi巨噬细胞的作用？）

D：monocle查看一些基因随细胞状态等的表达变化结果显示Rel表达高峰的时间点与CD72表达变化曲线相吻合，提示巨噬细胞表达CD72可能受到Rel调控。
E：为了证实这一点，作者进行了单核巨噬细胞系(THP-1和RAW 264.7)的ChIP-Seq分析。在人源巨噬细胞THP-1和小鼠巨噬细胞RAW 264.7，ChIP-Seq的峰值都位于CD72的调控区。
MEME工具做的motif预测得到5个CD72 promoter，其中包括Rel motif。荧光报告基因也证实了这个结果。（在supplementary Fig 7A, B）
F：Interestingly，常用来诱导巨噬细胞活化的IL10和LPS对CD72表达没有影响。而IFN-gamma和cytosolic extracts from mouse cardiomyocytes显著增加了BMDM中CD72表达。这个结果提示心肌损伤可以直接诱导巨噬细胞CD72表达。
G：在体内，移植了Rel过表达骨髓的小鼠，巨噬细胞CD72水平明显增加。
小结：Rel may be a key factor driving CD72^hi macrophages.

3. Rel驱动BMDMs诱导的心肌损伤具有CD72表达依赖模式

A：心肌和巨噬细胞共培养。心肌细胞与过表达Rel的BMDM共培养，心肌负荷指标(Anp和Bnp)和氧化酶类(Cybb, Sod2, Gsr和Prdx5)表达增加。而与CD72过表达的BMDM共培养，这些指标没有显著变化。
B：两种共培养对心肌细胞面积影响不大
C：与过表达Rel的BMDM共培养的心肌细胞胞质ROS水平显著升高
D：与过表达Rel的BMDM共培养的心肌细胞线粒体内容物(?)增加，但ATP产生下降。可能的原因是损伤的线粒体数目增加
E&F：有趣的是，尽管cd72过表达的BMDM对心肌细胞损伤更小，CD72敲除显著减轻了Rel引起的ATP产生减少和细胞死亡，提示Rel的破坏性作用是CD72依赖的。
G：给予anti-Tnf 和anti-IL6的抗体，死细胞的也减少，提示细胞死亡的诱导可能与促炎性细胞因子的作用有关。
小结：In summary, our data showed that Rel-driven CD72^hi BMDMs can induce apoptosis and reduce ATP production in cardiomyocytes in vitro, which is dependent on CD72 expression.

后面就是模式小鼠上的机制研究了，做的也比较常规。

Key Points：

1. Sup Fig1 用AUCell和training set+validation set来看得到的单细胞和既往文献报道分群的符合度
2. Fig1用单个基因来对不同细胞群的区分度来鉴别细胞群