Comprehensive Characterization of Tumor Purity and Its Clinical Implications in Gastric Cancer
胃癌中肿瘤纯度的综合表征及其临床意义
发表期刊：Front Cell Dev Biol
发表日期：2022 Jan 10
DOI: 10.3389/fcell.2021.782529
一、背景
胃癌（GC）是全球第五大流行性癌症，也是癌症相关死亡的第三大常见原因。由于早期缺乏症状，大多数GC患者通常在晚期才被诊断出来。GC是一种异质性疾病，不同的组织病理学和分子分类系统已被报道用于其诊断。迄今为止，肿瘤-淋巴结转移（TNM）分期系统被认为是预测GC患者预后和指导治疗决策的金标准方法。然而，GC的高异质性导致具有相同TNM阶段的患者接受相同治疗的不同结果，表明临床预测和治疗结果并不令人满意。
实体瘤组织包括源于各种癌症和非癌症组织的细胞成分，包括免疫细胞、基质细胞、内皮细胞和上皮细胞，这些非癌细胞构成了肿瘤微环境（TME）的重要组成部分，并与肿瘤细胞相互作用以维持肿瘤的生长和生存。随着对GC的TME多样性和复杂性的了解越来越多，这些由基质和免疫细胞代表的非癌细胞已被发现在致癌、恶性肿瘤进展和治疗耐药性中起重要作用。然而，目前可用的分类系统仅考虑GC组织中存在的非癌性因子，并且对GC细胞在各种纯度水平下的特征知之甚少。
二、材料与方法
1.数据来源
(1)接受过胃切除术作为主要治疗的214名GC患者（GSE184336）
(2)排除了缺少随访数据的和存活时间小于3个月的样本，共选取了12个未接受过公共治疗的 GC 队列（GSE62254/ACRG、GSE15459、GSE57303、GSE34942、GSE38749、GSE15456、GSE84437、GSE26901、GSE26899、GSE13861、GSE26253和TCGA-STAD）
(3)四个GC细胞数据集：CCLE、GSE22183、GSE15455和GSE146361
2.实验流程
(1)确定GC纯度和与纯度相关的共表达网络：肿瘤纯度是用ESTIMATE算法计算的；对TCGA-STAD队列中的GC组织进行了审查，以根据血红素和伊红（H&E）染色的全切片图像的视觉评价推断GC纯度；WGCNA软件包进行加权相关网络分析（WGCNA）
(2)GC纯度与临床、分子和预后特征的关系：进行模板预测（NTP）分析，根据已知的临床和分子特征对样本进行分类；单变量和多变量的Cox回归分析；使用限制性平均生存时间（RMST）分析比较高纯度和低纯度亚组之间的预后差异；GC纯度与其他独立的预后因素相结合，生成一个复合预后nomogram
(3)功能和通路富集分析：基因注释富集分析是使用clusterProfiler软件包；基因组富集分析（GSEA）用于筛选与GC纯度相关的生物过程；基因组变异分析（GSVA）用于量化使用GSVA包的途径富集分数
(4)GC微环境中浸润细胞的估计：使用ESTIMATE算法计算基质和免疫分数；使用MCPcounter和xCell算法来量化GC样本中的特定免疫和基质细胞；基于从TCGA-STAD队列中获得的H&E染色的全切片图像，使用卷积神经网络，识别数字化的H&E染色的组织标本中肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的比例
(5)对化疗潜在反应的估计：选择7种被批准用于GC治疗的常见化疗药物（5-氟尿嘧啶、顺铂、奥沙利铂、卡培他滨、紫杉醇、多西他赛和伊立替康）来预测化疗反应；两个公共药物敏感性数据库CTRP和PRISM，通过pRRophetic软件包预测化疗反应，使用脊回归来估计每个样本的AUC值
三、实验结果
1.肿瘤纯度是GC的内在属性
作者分析了40多个GC细胞系，涉及215个细胞样本，在GC细胞系中观察到高纯度。此外，微阵列和RNA-seq数据集之间没有发现明显的差异，这验证了ESTIMATE算法的有效性和稳健性。
在 GC meta数据集中，最初选择了来自13个队列的总共2599 个GC组织，排除存活时间少于 3 个月的样本后，保留了2259 个样本用于进一步分析。如图1A所示，GC样本按纯度递增排列，样品的纯度范围很广，中位数纯度为0.681。此外，评估了TCGA队列的179名患者中GC细胞的形态学特征（图1B）。与之前的研究结果一致，基于ESTIMATE算法评估的GC纯度与形态学显著相关（图1C）。然而，两种评价方法之间存在明显差异（图1D，E），这表明形态学评价只能提供GC纯度的定性评估。
此外，作者研究了来自同一病人的不同样本以确定其一致性。在GSE14209数据集中，22名患者进行了两次分析（化疗前和化疗后），观察到化疗前和化疗后的样本之间的高度一致性。结果表明，癌症患者中的肿瘤纯度水平是稳健和一致的，这意味着肿瘤纯度可能是GC的一个内在属性。
2.GC的纯度是由特定的临床病理和分子特征决定的
基于肿瘤纯度是GC内在属性的推测，作者评估了GC纯度与临床和分子特征之间的联系。发现GC纯度与诊断时的年龄之间呈负相关。根据TNM分期系统和组织病理学特征，GC样本被分为相应的临床病理学和分子特征。随着TNM分期的推进，观察到GC纯度的持续性下降（图2A）。根据Lauren的分类，肠道型GC的纯度最高，而扩散型GC的纯度最低（图2B）。这些结果表明，肿瘤的低纯度与GC的恶性进展密切相关。
根据临床特征，低纯度的GC样本更可能属于间充质亚型，而高纯度的GC样本更可能属于上皮亚型（图2C）。基于其他三种分子分类，即ACRG（图2D）、Singapore（图2E）和TCGA（图2F）分类系统，肿瘤纯度水平的降低与上皮-间质转化（EMT）和侵袭性或基因组稳定（GS）分子亚型有关，这通常与GC的侵袭和转移有关。这些发现表明，GC的纯度与特定的临床病理和分子特征密切相关。
3.GC纯度赋予不同的存活和复发结果
为了进一步评估GC纯度与其他临床变量相结合的预后价值，在GC meta数据集队列中基于综合临床病理变量进行了单变量和多变量的Cox比例风险回归分析。除了化疗史和TNM分期外，根据单变量分析，GC纯度被确定为总生存率（OS）和无复发生存率（RFS）的重要预测因子。
虽然EBV亚型的特点是纯度得分较低（图2F），但它与良好的预后有关，因此GC纯度和预后之间的关系不一定是线性的。作者使用限制性三次样条来评估GC纯度和预后之间可能存在的非线性关系。GC纯度与OS（图3A）和RFS（图3B）之间出现了非线性关系（U形曲线）。此外，利用X-tile软件确定的最佳临界值，将GC患者分层为两个（高或低纯度）和三个（高、中或低纯度）亚组。在两个亚组分析中，低纯度患者的OS（图3C,D）和RFS（图3E,F）率均低于高纯度患者。RMST差异也决定了高纯度的益处，而且这种益处似乎随着时间的推移而增加。这些结果表明，低GC纯度与较短的生存时间和更快的复发有关。
当所有相关的临床变量被纳入多变量Cox回归分析中时，GC纯度被确定为一个重要的预后因素。进一步进行了亚组分析以评估GC纯度与其他预后因素之间的关联。GC纯度与OS和RFS之间没有观察到明显的关联，这表明即使考虑了经典的临床病理预后特征，GC纯度仍然具有预后相关性。此外，整合了这些独立因素（肿瘤纯度、TNM分期和化疗史）建立了一个预测GC患者OS的预后列线图（图S2A）。校准图显示，在不同的时间点，列线图的预测和实际观察之间有最佳的一致性（图3G）。比较了列线图和临床模型之间的OS预测能力。在预测OS方面，列线图的C-指数明显高于临床模型（图3H）。此外，时间相关的ROC曲线证实，列线图在预测GC的预后方面表现得更好（图3I）。
最后，使用 DCA 曲线评估这两种模型的临床实用性和净收益。 在大多数阈值概率内，复合列线图显示出比临床模型更大的净收益（图 3J）。 RFS 也发现了类似的结果（补充图 S2B；图 3K-N）。 这些结果表明，将 GC 纯度整合到预后模型中可以显著提高其预测能力。 此外，列线图在预测预后方面表现出更好的临床实用性，强调了在临床实践中考虑 GC 纯度的要求。
4.对GC纯度的生物学见解
作者进行了主成分分析（PCA）来确定与GC纯度有关的转录组特征，发现mRNA表达谱与GC纯度之间有很强的关联（图4A），这意味着不同的GC细胞比例会导致不同的生物表型。
此外，使用GSEA来评估与GC纯度相关的生物特征。结果表明，不同GC纯度的样本表现出不同的生物学过程（图4B）。与临床和分子特征相一致，低纯度肿瘤与入侵、转移相关途径以及多种免疫相关途径有显著关联。然而，高纯度与新陈代谢和增殖相关途径有很大关系。随后，使用WGCNA来获得与纯度相关的模块，根据soft threshold power构建了一个聚类树状图，并确定了11个颜色模块。在确定的模块中，有四个与肿瘤纯度高度相关（图4C）。基因显著性与每个模块中的模块成员显著相关，表明这些模块中的基因可能发挥与GC纯度相关的重要作用。还进行了模块富集分析以探索纯度相关模块的生物学特征（图4D）。与GSEA的结果一致，红色模块中的基因富集于与代谢激活相关的途径，蓝色模块中的基因在增殖特定的途径中明显富集，绿松石和黄色模块中的基因分别与基质和免疫激活途径有显著的关系。
最后分析了TCGA队列中使用反相蛋白阵列产生的蛋白质组数据（图4E）。与临床和基因表达数据一致，α-连环蛋白、E-钙粘蛋白和其他关键的上皮粘附蛋白与肿瘤纯度呈正相关。低纯度肿瘤与MYH11、RICTOR和CAV1的高表达有关，它们是间充质谱系或EMT的标志。此外，低GC纯度与许多基质和免疫相关蛋白的表达增加有关，与基质和免疫激活途径有明显的关系（图4）。高GC纯度与多种增殖和代谢相关蛋白的表达增加有关。
5.GC纯度与不同的基质和免疫细胞的浸润有关
基于以上结论，作者进一步研究了TME特征和GC纯度之间的关系，以确定TME异质性的特征。基质和免疫评分（分别代表基质和免疫细胞在肿瘤组织中的整体浸润）都与GC纯度成反比（图5A），表明肿瘤纯度下降的TME，其基质和免疫细胞的浸润明显增加。此外，TILs被证实与GC纯度呈负相关（图5B,C）。使用MCPcounter算法来评估浸润基质和免疫细胞亚群与GC纯度的相对丰度（图5A）。T细胞、细胞毒性淋巴细胞、B系、髓系树突状细胞、单核细胞系、成纤维细胞和内皮细胞与GC纯度持续呈负相关。使用xCell算法进一步描述了TME的异质性（图5A），与之前的结果类似，发现成纤维细胞、内皮细胞、骨髓树突状细胞和一些T和B细胞类型与GC纯度呈负相关。
最后，作者试图评估这些纯度相关的基质和免疫细胞在GC中的预后影响（图5D）。生存分析显示，成纤维细胞和内皮细胞始终与较差的OS和RFS有关。然而，T细胞，特别是记忆T细胞，始终与较好的OS和RFS有关。xCell算法的结果显示，单核细胞可能与较差的OS和RFS相关。因此，T 细胞、成纤维细胞、内皮细胞和单核细胞可以是一组非肿瘤细胞，有助于不同纯度GC患者的TME和特定临床结果。
6.GC纯度与化疗反应密切相关
化疗是晚期GC患者的主要治疗方法。然而，化疗耐药性是治疗失败的主要原因。鉴于不同的临床、生物和微环境特征与GC纯度有关，作者进一步研究了GC纯度与化疗反应之间的关系。该分析是基于mate数据集中具有化疗数据的患者子集中进行的（n= 863）。在这863名患者中，有732人接受了辅助化疗。发现GC纯度可以作为辅助化疗获益的独立预测因素，高纯度的GC患者接受辅助化疗后有明显的OS获益。
此外，还确定了不同的纯度水平是否与辅助化疗的临床获益差异有关。在接受辅助化疗的患者中（n= 732），发现三个亚组之间存在明显的OS差异（图6A，B）。辅助化疗与高纯度和中纯度亚组GC患者的OS和RFS率显著增加有关（图6C,D）。然而，在低纯度亚组的GC患者中没有观察到辅助化疗的好处（图6E）。
最终，作者评估了GC纯度对促进个体化疗方案的价值。利用CTRP和PRISM得出的药物反应数据，对每个样本的药物敏感性结果进行脊回归预测（图6F）。AUC值和GC纯度之间的Spearman相关分析被用来选择具有显著相关系数的药物（图6G）。此外，在三个亚型中进行了差异分析，以确定每个亚组中估计AUC值较低的药物（图6H,I）。这些分析产生了两个CTRP衍生的化合物（氟尿嘧啶和紫杉醇）和四个PRISM衍生的化合物（氟尿嘧啶、卡培他滨、顺铂和奥沙利铂）。这些药物在高纯度亚组中的估计AUC值较低，并与GC纯度呈负相关，表明在肿瘤纯度低的GC患者中观察到了对这五种药物的化疗耐药性。
四、结论
这项研究强调GC纯度与临床，生物学，TME和药物反应特征密切相关。因此，GC的理想临床管理不仅应关注肿瘤细胞的性质，还应关注非肿瘤成分。全面评估GC个体患者的肿瘤纯度可以帮助阐明GC微环境的复杂作用，并为个体化治疗方案提供新的见解。