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丹参(Salvia miltiorrhiza,S. miltiorrhiza)是一种具有重要经济价值和药用价值的模式药用植物,丹参的根会合成一组称为丹参酮(tanshinone)的二萜类亲脂性生物活性成分。丹参酮的生物合成和调控引起广泛关注。DNA甲基化变化在调控植物种子发育、茎和叶生长、春化、果实成熟和次级代谢等方面发挥着重要作用。然而丹参的甲基化组尚未得到分析,DNA甲基化在丹参酮合成过程中的调节机制仍然未知。
2023年05月31日,中国医学科学院药用植物研究所研究员卢善发团队在《Hortic. Res.》杂志在线发表了题为“Characteristics of Salvia miltiorrhiza methylome and the regulatory mechanism of DNA methylation in tanshinone biosynthesis”的研究论文,该研究利用全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)等分析揭示了丹参酮积累与关键酶基因甲基化水平之间的相关性,并提示CHH甲基化水平在调控丹参酮生物合成中的意义。
标题:Characteristics of Salvia miltiorrhiza methylome and the regulatory mechanism of DNA methylation in tanshinone biosynthesis(丹参的甲基化表征及DNA甲基化在丹参酮生物合成中的调控机制)
发表期刊:Horticulture Research
发表日期:2023年05月31日
影响因子:IF 8.7/ 1区
技术:全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)、RNA-seq等
样品及方法:
摘要
本研究应用无偏好性的全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)分析了丹参根和叶的单碱基分辨率DNA甲基化组。比较分析揭示了CG、CHG和CHH序列的差异甲基化模式,以及DNA甲基化与基因和小RNA(sRNA)表达之间的关联。分析结果表明,低甲基化基因的表达水平较高,24nt sRNA(24-nucleotide sRNA)可能关键性参与丹参RdDM(RNA-directed DNA methylation)通路。DNA甲基化变异分析表明,CHH甲基化是造成差异的主要原因。Go富集分析表明,与March_root相比,hypoCHHDMR下游重叠基因在July_root的二萜生物合成过程显著富集。丹参酮生物合成相关酶基因如DXS2、CMK、IDI1、HMGR2、DXR、MDS、CYP76AH1、2OGD25和CYP71D373,在July_root基因启动子或下游区域中的CHH甲基化水平低于March_root。与March_root相比,July_root基因表达上调,DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷的处理显著促进了丹参酮合成。研究结果揭示了DNA甲基化通过改变丹参酮关键酶基因启动子或下游CHH甲基化水平,在丹参酮生物合成中起重要调控作用。
研究结果:
(1)丹参DNA甲基化通路相关基因及整体DNA甲基化模式
表1:丹参中推定的DNA甲基化通路基因
图2:丹参(S. miltiorrhiza )DNA甲基化图谱。
(2)DNA甲基化在基因表达中的作用
图2:DNA甲基化在基因表达中的作用。
(3)sRNA与DNA甲基化的相关性
图3:DNA甲基化与24nt sRNA的相关性。
(4)不同丹参(S. miltiorrhiza)样品DNA甲基化变化特征
图4:丹参全基因组DNA甲基化比较分析。
(5)DNA甲基化参与萜烯(terpenes)的生物合成和代谢
图5:与March_root相比,July_root的 hypoDMR相关基因在生物学过程显著富集。启动子表示启动子区域与hypoDMR重叠的基因。Body表示gene body与hypoDMR重叠的基因。Downstream表示下游基因与hypoDMR重叠的基因。
图6:丹参酮生物合成上游通路中的DMR相关酶基因。
(6)mCHH在关键酶基因启动子和下游区域对丹参酮生物合成的调控
图7:丹参酮生物合成下游通路中的DMR相关酶基因。
图8:5-氮杂胞苷在丹参毛状根丹参酮生物合成中的作用。
研究结论
本研究首次在丹参中绘制了单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。结果表明, DNA低甲基化可以上调丹参的基因表达,24nt sRNA可能是RdDM通路的主要参与者。此外,DMC/DMR分析表明,差异甲基化主要发生在CHH序列中,与March_root相比,July_root中与hypoCHHDMR相关的基因在萜烯生物合成过程中富集。最重要的是,在July_root和March_root之间的14个DMR相关丹参酮生物合成酶基因中,包括DXS2、CMK、IDI1、HMGR2、DXR、MDS、CYP76AH1、2OGD25和CYP71D373在内的9个基因在July_root基因启动子区或下游区域表现出CHH低甲基化。进一步的DNA甲基化抑制剂处理促进了丹参毛状根中丹参酮的生物合成。总之,DNA甲基化可以通过丹参酮生物合成酶基因启动子和下游的CHH去甲基化来促进丹参酮的生物合成。本研究为丹参酮生物合成的表观遗传学调控机制提供了新的见解,将有助于进一步提高丹参活性化合物的产量。
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序(WGBS)可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基(C碱基)的甲基化水平,是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持,能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中,也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶,在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列,连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U,进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向:
WGBS广泛用于各种物种,要求全基因组扫描(不错过关键位点)
技术优势:
易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案,详询易基因:0755-28317900。
参考文献:
Li J, Li C, Deng Y, Wei H, Lu S. Characteristics of Salvia miltiorrhiza methylome and the regulatory mechanism of DNA methylation in tanshinone biosynthesis. Hortic Res. 2023 Jul;10(7):uhad114.
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