基因长度并不是end-start

需求

tpm、fpkm这样的数据，计算公式里都有“基因有效长度”，有些地方直接叫基因长度。之前计算这些，都是采用最快的方式—找豆豆。今天想要把这部分逐渐加到课程里，我就必须要研究一下基因长度这个东东了。翻遍全网，找到了关于基因长度最优秀的描述，当属曾老板写的：基因长度知多少（给曾老板手动点赞）。

其中的基因长度依据的参考基因组是hg19，我想要的是从gtf文件开始计算，在曾老板的代码基础上改吧一下就行。因为可能要涉及到其他物种，或者其他版本，这个需求还是比较普遍的。

1.从gtf文件开始

gtf文件的下载，主要是GENECODE和ENSEMBL这两个网站，搜一哈，点进去就能找到最新版本。（目前最新版本是103，以后肯定是继续更新的）如果是其他模式生物，可以自己查查参考基因组注释文件从哪里下载。

library(rtracklayer)

gtf = rtracklayer::import("Homo_sapiens.GRCh38.103.chr.gtf.gz")
class(gtf)

## [1] "GRanges"
## attr(,"package")
## [1] "GenomicRanges"

gtf = as.data.frame(gtf);dim(gtf)

## [1] 3073646      27

table(gtf$type)

## 
##            gene      transcript            exon             CDS     start_codon 
##           60607          234326         1460128          806304           91602 
##      stop_codon  five_prime_utr three_prime_utr  Selenocysteine 
##           84603          160663          175296             117

首先把gtf读取进R语言，会成为一个Grange对象。不了解Grange无所谓的，反正可以转换成数据框。这里面有约300万行（不同版本行数不一样，逐渐进化中）。

其中基因占了6w，转录本、外显子、CDS都被单独罗列出来了。

引用曾老板，几种主流的基因长度计算方法：

挑选基因的最长转录本

选取多个转录本长度的平均值

非冗余外显子(EXON)长度之和

非冗余 CDS（Coding DNA Sequence）长度之和

今天就玩这个啦！挨个试试。

1.挑选基因的最长转录本

library(tidyverse)

tra = gtf[gtf$type=="transcript",
          c("start","end","gene_name")]
length(unique(tra$gene_name))

## [1] 59409

glt = mutate(tra, length = end - start) %>%
  arrange(desc(length)) %>% 
  filter(!duplicated(gene_name)) %>% 
  select(c(3,4))
head(glt)

##   gene_name  length
## 1    RBFOX1 2471656
## 2   CNTNAP2 2304197
## 3      DLG2 2172171
## 4       DMD 2092327
## 5     PTPRD 2084571
## 6     CSMD1 2059553

2.选取多个转录本长度的平均值

gltm = mutate(tra, length = end - start) %>%
  group_by(gene_name) %>% 
  summarise(length = mean(length))
head(gltm)

## # A tibble: 6 x 2
##   gene_name length
##         
## 1 5_8S_rRNA   151.
## 2 5S_rRNA     112.
## 3 7SK         266.
## 4 A1BG       4146 
## 5 A1BG-AS1   6124.
## 6 A1CF      68834.

3.非冗余外显子(EXON)长度之和

exon = gtf[gtf$type=="exon",
           c("start","end","gene_name")]

length(unique(exon$gene_name))

## [1] 59409

if(F){
  gle = lapply(split(exon,exon$gene_name),function(x){
    tmp=apply(x,1,function(y){
        y[1]:y[2]
    })
    length(unique(unlist(tmp)))
  })
  gle=data.frame(gene_name=names(gle),
               length=as.numeric(gle))
  save(gle,file = "gle.Rdata")
}
load("gle.Rdata")

head(gle)

##   gene_name length
## 1 5_8S_rRNA    911
## 2   5S_rRNA   1021
## 3       7SK   1870
## 4      A1BG   3999
## 5  A1BG-AS1   3374
## 6      A1CF   9603

4.非冗余 CDS长度之和

CDS = gtf[gtf$type=="CDS",
          c("start","end","gene_name")]

length(unique(CDS$gene_name))

## [1] 20382

if(F){
  glc = lapply(split(CDS,CDS$gene_name),function(x){
    tmp=apply(x,1,function(y){
        y[1]:y[2]
    })
    length(unique(unlist(tmp)))
  })
  glc=data.frame(gene_name=names(glc),
               length=as.numeric(glc))
  save(glc,file = "glc.Rdata")
}
load("glc.Rdata")

head(glc)

##   gene_name length
## 1      A1BG   1572
## 2      A1CF   1905
## 3       A2M   4422
## 4     A2ML1   4502
## 5   A3GALT2   1020
## 6    A4GALT   4236

比较一下几种方法得到的基因长度

a = gle %>% inner_join(glc,"gene_name") %>% 
  inner_join(glt,"gene_name") %>% 
  inner_join(gltm,"gene_name")
colnames(a) = c("gene_name","exon","CDS","tra_max","tra_mean")
a[1:4,]

##   gene_name exon  CDS tra_max tra_mean
## 1      A1BG 3999 1572    8309  4146.00
## 2      A1CF 9603 1905   86266 68834.40
## 3       A2M 6318 4422   48211 11661.31
## 4     A2ML1 7156 4502   54166 17511.89

boxplot(log2(a[,-1]),outline = F)

接下来是一点补充讨论

其实上面列出来的几种方法，用哪个都可以的。我问豆豆,你说这里面哪个最好呢。豆豆说，他用非冗余外显子。好的，以后没什么特殊要求，默认的长度就它了。为什么呢？因为默认大(lao)佬(gong)说的都是对的。

有选择困难症的时候，最简单的办法是看看大佬是怎么做的。查查文献或者翻翻网上的帖子都行呗。

豆豆还找到了一篇关于基因长度的文章，还挺新的，这一篇里面选择了最长转录本长度作为基因长度。
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fgene.2021.559998/full

对接count与fpkm、tpm的转换

豆豆写过了，我选择直接复制粘贴：https://www.jianshu.com/p/9dfb65e405e8