这一篇继续学习一些免疫方面的内容，参考文献在Global analysis of shared T cell specificities in human non-small cell lung cancer enables HLA inference and antigen discovery，2021年3月发表于Immunity，，免疫是一门很深的学问，之前分享了很多了，但是还是盲区太多，看来免疫学作为一门专门的学科大类是有道理的。
Highlights
- The algorithm GLIPH2 enables analysis of shared TCR specificity and HLA prediction
- Tumor-infiltrating T cells cross-react to EBV antigens and shared tumor antigens
- EBV-specific T cells expanded in patients responding to immune checkpoint blockade
- Cross-reactive CD8 T cells express GZMK
Summary
为了识别具有共享抗原特异性的疾病相关 T 细胞受体 (TCR)，使用 GLIPH2（grouping of lymphocyte interactions with paratope hotspots 2）算法分析了来自 178 名非小细胞肺癌患者的 778,938 个 TCRβ 链序列。分析确定了超过 66,000 个共享特异性组，其中 435 个与邻近肺相比，在肿瘤中克隆扩增并富集。使用酵母肽-HLA A*02:01 展示文库鉴定了这样一个富含肿瘤的特异性组的抗原表位。这些包括来自上皮蛋白 TMEM161A 的肽，它在肿瘤中过度表达，以及来自 Epstein-Barr 病毒和大肠杆菌的交叉反应表位。研究结果表明，这种交叉反应可能是肿瘤浸润物中病毒特异性 T 细胞存在的基础，并且病原体交叉反应可能是多种癌症的特征。在这项工作中产生的方法和分析管道，以及这里定义的特异性组，为了解癌症中的 T 细胞反应提供了资源。
Introduction
尽管广泛使用免疫疗法治疗癌症，但我们对这种疾病中 T 细胞特异性的了解非常有限。 抗原特异性是 T 细胞功能的关键决定因素，但 T 细胞受体 (TCR) 多样性和人类白细胞抗原 (HLA) 等位基因多态性带来的挑战一直是了解肿瘤浸润性 T 细胞识别的全部抗原的主要障碍。 已经描述了识别突变蛋白（即新抗原）、非突变肿瘤相关抗原 (TAA) 和病毒抗原的肿瘤浸润 T 细胞。 在没有已知病毒病因的肿瘤中，先前的报告已经确定了浸润肿瘤的病毒特异性 T 细胞，包括识别流感 (flu)、爱泼斯坦-巴尔病毒 (EBV) 或巨细胞病毒 (CMV) 的 T 细胞。 在这些肿瘤中，病毒特异性肿瘤浸润性 T 细胞被认为不识别肿瘤抗原，通常被称为“bystander cells”。
在寻找 TAA 方面，新一代测序已经能够对肿瘤浸润性 T 细胞中的大量 TCR 可变区进行快速测序，但在利用生成的数据方面仍然存在挑战。 这部分是由于成百上千个不同的 TCR 序列可以识别相同的肽-主要组织相容性复合体 (MHC) 配体。 为了将这种巨大的序列多样性减少到更少的特异性，作者开发了一种算法 GLIPH（通过互补位热点对淋巴细胞相互作用进行分组）和改进版本 (GLIPH2)，它将大量 TCR 序列解析为共享的特异性组 极有可能识别相同的肽-MHC 配体。 这些共享的特异性组是基于相同的氨基酸序列motif或 TCRβ 链的互补决定区 3 (CDR3) 内的强同源性建立的。 （这个是目前TCR研究的主要方向）。
在这里，使用 GLIPH2 从 178 名可手术切除肿瘤的非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者中发现的 778,938 个 CDR3β 序列中识别出超过 66,000 个高质量的共享特异性组。与相邻肺组织相比，435 个共享特异性组在肿瘤中被克隆扩增。其中，包含“S%DGMNTE”序列motif的 CDR3β 序列优先用于使用 HLA-A*02 酵母展示文库进行抗原发现，其中“%”表示不同的氨基酸。具有“S%DGMNTE CDR3β”motif的 T 细胞对非突变肿瘤抗原 TMEM161A 以及来自 EBV 和大肠杆菌的抗原有反应，表明 T 细胞与 TAA 和常见病原体具有交叉反应性。此外，我们发现了内源性抗原和 EBV 表位之间交叉反应的第二个例子，以及另外两个例子，其中 EBV 特异性 CDR3β 序列在对抗 PD-1 治疗有临床显著反应的患者中进行了克隆扩增。这表明病原体交叉反应性可能是瘤形成和 T 细胞免疫相互作用的一个重要特征。总体而言，此处介绍的方法能够对人类癌症中共有的 T 细胞特异性进行综合分析，并使用酵母展示库识别特定抗原，并更广泛地应用于其他癌症类型。
Results
Defining shared specificity groups for tumor-infiltrating T cells in human lung cancer
如前所述，GLIPH2 基于局部motif和/或全局同源性识别极有可能具有共享肽-MHC 特异性的 CDR3β 序列。 为了识别识别肺癌中共享肿瘤抗原的 T 细胞，将 GLIPH2 应用于最近发表的 MD Anderson 癌症中心 (MDACC) 数据集，该数据集包含来自 NSCLC 肿瘤和邻近肺部的 778,938 个不同的 CDR3β 序列。 该临床队列代表 178 名患有可手术切除的疾病且具有可用 HLA 数据的患者。 我们首先用一组特定的过滤标准定义了共享特异性组，并确定了 66,094 个共享特异性组。 为了关注与疾病最相关的 TCR，我们进一步确定了 4,226 个具有克隆扩增证据的特异性组，其中 435 个与相邻肺相比富含肿瘤。 因此，推断这 435 个富含肿瘤的特异性组的 CDR3β 成员识别尚未发现的 TAA。
接下来，推断识别共享肿瘤抗原的 T 细胞会在 NSCLC 患者中进行克隆扩增，但不会在没有癌症的个体中进行。 分析观察到，与其余扩增较少的 TCR 相比，属于 435 个富含肿瘤的特异性组的 MDACC NSCLC 队列中扩增的 CDR3β 克隆的百分比显著更高。 在来自代表 68 名 NSCLC 患者的 202 个肿瘤样本的 1,173,806 个 CDR3β 序列的验证队列中进行了类似的观察。 相比之下，癌症患者的相邻肺（未受肿瘤累及）、健康供体的肺或慢性阻塞性肺病（COPD）患者的肺（无癌症诊断）具有较少的属于富含肿瘤的特异性组的 CDR3β 克隆。 总之，这些数据表明 GLIPH2 成功地将大量 CDR3β 序列数据集解析为数百个与 NSCLC 疾病相关的富含肿瘤的特异性组。
Viral specificity group inferences from HLA tetramer datasets
为了验证由 GLIPH2 建立的共享特异性组，将来自公开可用 HLA 四聚体数据库的 CDR3β 序列与 MDACC CDR3β 序列结合起来进行联合 GLIPH2 分析。公开可用的四聚体 CDR3β 序列主要涵盖病毒特异性，并在实验中显示在其各自 HLA 的背景下结合表位。这使我们能够用 CDR3β 序列在其 HLA 的背景下与独特的表位相连来注释一些特异性组，从而推断其余 CDR3β 成员的共享特异性。联合分析注释了 66,094 个共享特异性组中的 394 个。在这些特异性组中，71 个被克隆扩增并用 10 个不同的四聚体进行了注释。我们发现，与邻近肺相比，对流感、EBV 或 CMV 衍生抗原具有推断特异性的 CDR3β 序列在肿瘤中总体上没有表现出偏差。此外，这些病毒特异性 CDR3β 克隆的估计频率远高于初始水平（每 105-106 个），并且与先前报告的通过 HLA 四聚体染色测量的范围相当。 27 个扩展的流感 M1 注释特异性组中的 13 个携带“RS”或“GxY”motif，已知这些motif对于与流感-M158-66 肽/HLA-A*02 的结合至关重要。网络分析将这些具有相同 CDR3β 序列成员的四聚体注释的特异性组组织成社区。属于给定社区的特异性组始终用相同的 HLA 四聚体注释，表明某些抗原特异性组虽然共享不同的序列motif，但表现出相同的特异性和 HLA 限制。在用四聚体注释的 394 个共享特异性组中，634 个相同的 CDR3β 序列成员中有 588 个（93%）连接了用相同四聚体注释的特异性组。在用四聚体注释的 71 个克隆扩展的特异性组中，92 个相同的 CDR3β 序列成员中的 92 个（100%）连接了用相同四聚体注释的组。该结果表明，虽然 CDR3β 序列不是特异性的唯一决定因素，但在绝大多数情况下，对 CDR3β 序列的 GLIPH2 分析会导致正确的特异性推断。
HLA allele enrichment within TCR specificity groups makes robust inferences of HLA restriction
我们接下来检查了特异性组内的 HLA 等位基因富集是否准确反映了四聚体注释的 HLA context。分析量化了所有用四聚体 CDR3β 序列注释的克隆扩展特异性组中 HLA 超型的富集。这里专注于 HLA-A*02 和 HLA-B*08 超类型，因为这些四聚体定义的 HLA context在 MDACC 数据集中最为丰富。分析推断，如果给定的特异性组由 HLA/肽四聚体注释，则 GLIPH2 观察到属于同一超型的 HLA 等位基因富集的可能性应该更高。事实上，所有 HLA-A*02 四聚体注释的特异性组中有 36.7% 富含 HLA-A*02 超型等位基因，而用非 A*02 四聚体注释的组中没有一个被富集。虽然 62.5% 的 HLA-B∗08 四聚体注释的特异性组富含 HLA-B∗08 超型等位基因，但只有 3.13% 的非 B∗08 四聚体注释的组被富集。因此，特定组内给定 HLA 等位基因的富集准确反映了同源抗原的 HLA 背景。先前的工作还通过在报告基因 T 细胞中表达 TCR 异二聚体并鉴定其肽-MHC 特异性来验证推断的 HLA restricting element。
Inferred T cell specificities enable robust comparisons of T cell repertoires across patients
使用 GLIPH2 建立 TCR 特异性组的主要优势之一是它极大地促进了跨个体的 TCR 库分析。 在 MDACC 肺癌数据集中，平均约 0.4% 的曲目在任何两名患者之间共享。 在考虑 4,226 个共享特异性组（富含克隆扩增的 TCR 序列）时，测量此类共享特异性的可能性增加到 1.9%，在考虑所有 66,094 个共享特异性组时增加到 5.3%。 这表明 GLIPH2 捕获了 T 细胞库中的共享特异性，其程度是仅通过比较个体之间的 CDR3β 序列是不可能的。
接下来，推断如果在特定疾病背景下存在有限数量的共享 TCR 特异性，那么在给定足够多的患者的情况下，特异性组的数量应该达到饱和。通过从携带至少一个最流行的 HLA-A02:01 等位基因副本的患者中进行引导，我们发现富含 HLA-A02:01 的特异性组的数量在约 70 名患者时达到饱和。需要来自至少九名患者的Repertoires来建立所有特异性组的一半（n = 77）。相比之下，来自 A∗02:01 阴性患者的并发引导占 A∗02:01 丰富的特异性组的比例要少得多。此外，来自具有可比 CDR3β 测序深度的独立健康队列的引导在相似的样本量下并未达到饱和，这与携带 A*02:01 等位基因的 NSCLC 患者中属于这些特异性组的 TCR 的患病率较高一致。值得注意的是，建立一半特异性组所需的患者数量取决于克隆扩增的水平、特异性组的数量和测序深度。因此，可以用有限的患者数量建立一套完整的 TCR 特异性组。此外，这些结果表明 HLA 等位基因富集增强了 T 细胞特异性推断。
Experimental validation of GLIPH2-inferred specificities
鉴于 T 细胞特异性的实验验证需要 TCRα/β 对，因此对斯坦福大学治疗的 15 名早期 NSCLC 患者进行了单细胞 TCR 测序（scTCR-seq）。从手术切除的标本中制备肿瘤浸润性 T 细胞，并在测序前通过荧光激活细胞分选 (FACS) 对索引进行分选。 scTCR-seq 产生了 4,704 个配对的 CDR3α 和 CDR3β 序列。将这些 CDR3β 序列与 MDACC NSCLC 序列结合起来进行 GLIPH2 联合分析。选择验证属于三个流感 M1 注释特异性组（SV%SNQP、SIRS%YE 和 S%RSTDT）和一个 EBV BMLF1 注释特异性组 (RTG%GNT) 的四个 T 细胞克隆。我们使用同时缺乏 TCR⍺ 和 TCRβ 的 Jurkat 76 细胞来表达四种 TCR 候选物，并将它们与用各自肽脉冲的 HLA-A*02+ T2 细胞共培养。他们中的三个在 HLA-A*02 的背景下对他们预测的抗原做出了反应，显示了 GLIPH2 在推断 T 细胞特异性方面的稳健性。对结核分枝杆菌研究中特异性组成员的类似分析发现，约 80%–90% 的 TCR 识别预测的肽-MHC 配体。
Characterization of tumor-enriched specificity groups
为了确定与疾病相关的特异性组，我们重点研究了 435 个富含肿瘤的特异性组，这些组与相邻肺相比，显示出肿瘤中的强烈克隆偏倚。使用来自 84 名患者（总共 n = 178）的转录组数据，我们发现属于这些富含肿瘤的特异性组的 T 细胞的百分比与癌症进展的基因集富集分析 (GSEA) 标志性特征相关，包括 MYC 和细胞周期程序。相比之下，使用在相邻肺中扩展的特异性组（n = 114），我们未能观察到与 GSEA 标志基因集的任何显著相关性。因此，该结果显示了 435 个富含肿瘤的特异性组与侵袭性、高度增殖性癌症表型之间的相关性。接下来，我们系统地检查了 MDACC 队列中 435 个富含肿瘤的特异性组中所有 HLA 等位基因的富集情况，并且在大多数情况下仅发现了一个主要等位基因。值得注意的是，我们发现在motif富含多个主要等位基因的情况下，例如，同时富含 HLA-B*07:02 和 HLA-C*07:02 的那些，相关 HLA 等位基因中的强连锁不平衡可能被观察。
Identification of a shared specificity group cross-reactive to tumor and pathogen-derived antigens in human lung cancer
在 435 个富含肿瘤的特异性组中，我们优先考虑满足以下标准的那些：（1）具有来自斯坦福队列的配对 TCRα/β 克隆型和（2）通过 Fisher 精确检验显著富含 HLA-A*02 等位基因。 这使我们专注于具有“S%DGMNTE”CDR3β motif的特异性组。 因此，选择带有 CDR3α 序列 CAVLMDSNYQLIW 和 CDR3β 序列 CASSGDGMNTEAFF 的候选 TCRα/β 克隆型（称为 TCR2）用于抗原鉴定.
为了鉴定候选克隆 TCR2 的同源表位，我们在野生型 HLA-A*02:01 的背景下筛选了展示四种不同长度（8-11 个氨基酸）肽的酵母文库。使用 TCR2 多聚体进行的四轮选择导致 11 聚体文库中肽序列（模拟表位）的富集（表 S5）。我们对前 20 个富集的拟表位进行了体外刺激试验，结果显示前两个序列“AMGGLLTQLAM”和“KLGGLTMVGV”刺激了表达 TCR2 的 Jurkat 细胞（Jurkat-TCR2）。蛋白质数据库搜索 (UniParc) 导致鉴定出多个内源性 9 聚体，这些 9 聚体与前两个拟表位具有密切的序列相似性，并预测结合 HLA-A*02:01，锚定点间隔为 6 个而不是 8 个氨基酸.事实上，顶级模拟表位的 9 聚体变体将 Jurkat-TCR2 细胞刺激到与 11 聚体对应物相当的水平。该结果表明鉴定的 HLA-A*02 抗原实际上是 9 聚体。
在功能上验证了所有候选内源性肽 9 聚体，类似于前两个模拟位（11 聚体）。 我们发现来自哺乳动物蛋白 TMEM161A (TMEM9-mer, ALGGLLTPL) 的 9-mers、来自 EBV 的潜伏膜蛋白 2a (LMP9-mer, CLGGLLTMV) 和来自大肠杆菌的肠杆菌素输出蛋白 (EntS9-mer, LLGGLLTMV) 可以 都刺激 Jurkat-TCR2 细胞。 这些结果表明 TCR2 与来自人类和病原体的抗原发生交叉反应。 HLA 限制的准确 GLIPH2 推断促进了 HLA-A*02:01 酵母文库的抗原发现。
为了表明全长蛋白质 TMEM161A、LMP2 和 EntS 可以被处理，呈现在 HLA-A*02:01 上，并激活特定的 T 细胞，在 HLA-A*02+ 293T 细胞中过表达这些蛋白质并测量了 表达 TCR2 的共培养原代 T 细胞的反应。 与脉冲肽类似，表达全长 TMEM161A、LMP2 和 EntS 的 293T 细胞都刺激了共培养的 TCR2-T 细胞，其中 TMEM161A 似乎是最弱的刺激物。 我们进一步进行了生物层干涉测量，以量化每个交叉反应表位对 TCR2 的结合亲和力，并表明最弱的刺激物 TMEM9-mer 显示与 TCR2 的最稳定结合。 因此，该结果表明结合亲和力和信号强度的部分解耦，类似于之前的报告。 总之，我们确定了一个富含肿瘤的 TCR 特异性组，对 TAA 和病原体衍生的抗原具有交叉反应性。
TMEM161A is overexpressed on human lung cancer
发现与邻近肺组织相比，人肺癌中 TMEM161A 蛋白的表达水平显著更高。我们还注意到一些肿瘤切片上 TMEM161A 表达的一些异质性。我们还检查了癌症基因组图谱 (TCGA) NSCLC 数据集中的 TMEM161A 基因表达。与蛋白质表达一致，我们发现与相邻肺相比，肿瘤中 TMEM161A 转录物的水平更高。与腺癌相比，肺鳞状细胞癌 (SCC) 中 TMEM161A 的表达水平更高。斯坦福大学队列样本的全外显子组测序未发现 TMEM161A 基因座编码区内的任何突变，支持其作为非突变 TAA 的作用。同样，在泛肺癌 TCGA 数据集中发现 TMEM161A 基因座中不到 1% 的有害突变 (n = 6/1053)。此外，肺癌中 TMEM161A 的表达与与细胞增殖程序和原癌基因 MYC 靶标相关的 GSEA 特征相关，这与 435 个富含肿瘤的特异性组揭示的总体趋势一致。相比之下，TMEM161A 表达似乎与炎症反应相关的基因组呈负相关。这些数据表明，TMEM161A 是一种在人类 NSCLC 中过度表达的 TAA，并与基因表达特征（如 MYC 和细胞周期）相关。
T cells recognizing TMEM161A antigen have the “S%DGMNTE” sequence motif
我们进一步query了体内 TMEM161A 特异性 CD8+ T 细胞的 TCR 序列身份并检查了它们的临床相关性。可以在 MDACC NSCLC 队列中的 31/78 (40%) HLA-A*02+ 患者中检测到 TMEM161A 特异性 T 细胞。我们使用 TMEM9-mer/HLA-A*02 四聚体从患者 A6 的肿瘤中分选 T 细胞，其中 TCR2 克隆首次被鉴定。来自肿瘤和邻近肺的 TMEM9-mer/A02 四聚体 + T 细胞的 scTCR-seq 证实它们携带“S%DGMNTE”motif，这与它们在体内对 TMEM161A 的识别一致。我们接下来研究了肿瘤特征如何影响 HLA-A02+ 患者中具有“S%DGMNTE”motif的 T 细胞的募集。我们观察到，与腺癌相比，在 SCC 中更频繁地观察到具有“S%DGMNTE”motif的 T 细胞，类似于 TMEM161A 的表达模式。我们还注意到，突变计数小于 500 的肿瘤中具有“S%DGMNTE”motif的 T 细胞百分比高于突变计数大于 500 的肿瘤（总 n = 34），尽管这一观察结果可能受总浸润性 T 细胞数量和突变负荷之间的关联的影响。最后，虽然在肿瘤中检测到的带有“S%DGMNTE”motif的 T 细胞并不能预测患者的预后，但我们观察到带有“S%DGMNTE”CDR3β motif的 T 细胞属于 146 个在没有复发。
CD8+ T cells with the “S%DGMNTE” motif were also detected in healthy donors
为了表征交叉反应性 TMEM161A 特异性和病原体特异性克隆型，我们使用 TMEM9-mer/HLA-A*02 四聚体或 EntS9-mer/HLA-A*02 四聚体从 HLA-外周血中分选 CD8+ T 细胞。 A∗02+ 健康供者和 FACS 的 NSCLC 患者。 我们发现健康供体和肺癌患者中 HLA-A*02/TMEM9-mer+ CD8 T 细胞的频率没有差异，这表明这些 T 细胞可能由于与病原体衍生抗原的交叉反应而得以维持。 与此一致，由四聚体或 GLIPH2 量化的这些特定 T 细胞的频率约为每 103–105 个 T 细胞中的一个（四聚体测量：0.0032%–0.0980%；GLIPH2 推断：0%–0.2643%） ，高于人 CD8+ T 细胞的初始水平。
无论使用哪种四聚体来分选外周血 T 细胞，分选细胞的 CDR3β 序列始终带有“S%DGMNTE”motif。 事实上，我们发现了多种 CDR3β 序列共享“S%DGMNTE”motif，其中 % 可能是甘氨酸、谷氨酸或丝氨酸，证实了使用 MDACC 数据在 GLIPH2 分析中看到的多样性。 此外，单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 数据表明 HLA-A*02/TMEM9-mer+ 细胞主要表现出效应 T 细胞状态，表明它们以前曾遇到过它们的同源抗原，即使在健康个体中也是如此。
为了在功能上验证来自四聚体分选克隆的 CDR3α/β 序列，我们生成了稳定的 Jurkat 细胞，表达了用四聚体鉴定的 TCRα/β 链。然后，我们在 HLA-A*02:01 的背景下量化了它们对 TMEM9-mer 和病原体衍生的 9-mers 的反应性。我们发现具有“S%DGMNTE”CDR3β motif的 Jurkat 细胞克隆只有在与允许的 TCR2α 链（CDR3α：CAVLMDSNYQLIW）配对时才能对所有交叉反应肽产生反应。例如，我们鉴定了一个 CDR3α/β 对，它不携带“S%DGMNTE”motif并识别 TMEM9-mer 但不识别微生物抗原 (TCR16)。最后，我们通过将 HLA-A*02+ 肺癌细胞系 H1395 与表达 TCR2 的原代 T 细胞共培养，量化了由交叉反应表位诱导的细胞介导的细胞毒性。与无肽对照相比，LMP9-mer 和 TMEM9-mer 均诱导了超过 50% 的靶细胞裂解。与使用 LMP9-mer 的癌细胞相比，用 TMEM9-mer 脉冲的癌细胞是细胞介导的细胞毒性较弱的靶标，这与 T 细胞活化研究的结果一致。总之，具有“S%DGMNTE”motif的 CD8+ T 细胞与 TMEM161A 肿瘤抗原和病原体衍生抗原 EntS 和 LMP2 与允许的 α 链配对时发生交叉反应。识别 HLA-A*02 上的这些交叉反应抗原导致带有“S%DGMNTE”motif的 CD8+ T 细胞裂解靶细胞。
Phenotypic characterization of TMEM161A-specific CD8+ T cells in lung cancer
我们使用 SMART-seq 方法对来自 10 名 NSCLC 患者的 2,950 个分选的肿瘤浸润 T 细胞的完整单细胞转录组进行了测序，并获得了它们的配对 CDR3α/β 库。分析确定了 14 种主要细胞状态，其中 13 种可以映射到单独队列中报告的那些状态。cluster c5、c6、c12（具有效应表型的 CD8+ T 细胞）、c7 和 c10（具有常驻记忆表型的 CD8+ T 细胞）是扩展最多的。为了揭示特定于共享抗原的克隆的细胞状态，检查了 TCR 特异性组成员的 scRNA-seq 谱。我们发现 2.9% 的 T 细胞 (n = 86/2950) 属于克隆扩增的特异性组。这些 T 细胞中有 12 个是 435 个富含肿瘤的特异性组的成员，而这些 T 细胞中有 13 个被推断为对病毒表位具有特异性。有趣的是，属于富含肿瘤的特异性组的 T 细胞偏向于效应表型 (c5)，并且差异表达的 EOMES、KLRG1、GZMK 和其他基因在活化的自然杀伤细胞中表达。一致地，来自肿瘤的 HLA-A*02/TMEM9-mer 四聚体分选的 CD8+ T 细胞也优先表现出效应 T 细胞表型 c5。伪时间轨迹和激活/耗竭特征评分表明这些 T 细胞采用不同的细胞状态。相比之下，推断为病毒特异性的 T 细胞表现出的细胞状态包括效应子 (c5、c6、c12) 和组织驻留记忆表型 (c7)。总之，TMEM161A 特异性 CD8+ T 细胞在 NSCLC 中显示出一系列效应 T 细胞状态，与原位识别其同源抗原一致。
Expansion of EBV-specific T cell clones in patients responding to immune checkpoint blockade
为了了解病原体特异性 T 细胞是否可能影响对抗 PD1 检查点免疫疗法的临床反应，我们分析了两名对治疗有临床反应的 NSCLC 患者的 TCR 库。我们对治疗前和治疗后的血液样本中的配对 CDR3α/β 库进行了测序，并鉴定了 102 个在治疗后样本中扩增的 CDR3β 克隆型。在这些扩增的克隆中，41 个属于在肿瘤浸润性 T 细胞 CDR3β 库中鉴定的 99 个特异性组（总 n = 66,094）。我们使用四聚体定义的 T 细胞 CDR3β 序列来注释这些特异性组，发现 11 个（总共 n = 99）包含 3 个推断识别 EBV 和流感抗原的扩展 CDR3β 克隆。为了验证特异性推断，我们创建了两个表达 TCRα/β 链的 Jurkat 细胞克隆，推断可以识别 EBV 抗原，以及一个表达野生型 B35 的 T2 细胞系。事实上，在与 T2-B35 细胞共培养后，Jurkat-TCR27 和 -TCR28 细胞都对预测的 EBV 肽有反应。值得注意的是，这些 EBV 特异性特异性组不仅在治疗后得到了扩展，而且与相邻肺相比，还显示出肿瘤的偏倚，表明对未知 TAA 的潜在交叉反应。此外，我们发现从患者 A11 鉴定的 EBV 特异性克隆 TCR15（CDR3β：CSARGVGNTIYF）被推断具有与先前报道的在临床反应时接受免疫检查点阻断的患者中检测到的两个克隆相同的抗原特异性（CDR3β：CSARVGVGNTIYF和 CSARSGVGNTIYF)。我们的分析表明，这些克隆属于预测在 HLA-A*02 背景下识别 EBV-BMLF1 (GLCTLVAML) 的“R%GVGNT”特异性组。我们进一步测试了来自人类 ORFeome 的三个相似表位，这些表位被预测为结合 HLA-A*02，发现来自人类 CLDN2 基因座的内源性“LLGTLVAML”也刺激了 Jurkat-TCR15 克隆，表明 TCR15 确实与两者交叉反应EBV 和 TAA。总之，这些结果表明，患者体内的病原体特异性 T 细胞可能在免疫检查点抑制剂治疗后的抗肿瘤免疫反应中发挥作用。
Discussion
虽然最近关于癌症中 T 细胞特异性的工作集中在个体通常独有的新抗原上，但先前的工作也描述了在肿瘤中不适当表达或过度表达的共享肿瘤抗原。在这里，我们开发了一种方法来系统地调查大量 NSCLC 患者的 TCR 库，以发现共享的 T 细胞特异性。使用 GLIPH2 算法，我们首先将原始 TCR 序列数据提炼成一个更小、更有用的共享特异性组集合，并推断出 HLA 限制。然后，我们将与疾病相关的 TCR 候选者优先考虑用于抗原发现。酵母文库的巨大多样性极大地促进了抗原鉴定和交叉反应抗原的发现。与在哺乳动物细胞中构建的其他 MHC/肽库不同，酵母库包含近 109 个随机排列的肽序列。虽然以前 HLA 限制的不确定性限制了使用酵母文库进行抗原识别的成功，但我们通过使用 GLIPH2 来推断候选 TCR 的正确 HLA context克服了这一限制。
在肺癌中使用这种方法，我们发现了 TCR 与肿瘤和微生物抗原交叉反应的例子。因此，这似乎是对病原体特异性 T 细胞浸润肿瘤的报道的可能解释。我们之前提出，维持广泛的 T 细胞库以抵御病原体可能在很大程度上依赖于 TCR 交叉反应性。已在健康个体的外周血中检测到自身抗原特异性 T 细胞，在胸腺中修剪但未克隆性删除，可能避免病原体的免疫“盲点”。由于癌细胞过度表达自身抗原，T 细胞对自身抗原的特异性可能部分解释了为什么之前的研究观察到肿瘤浸润性 T 细胞对自体肿瘤的低反应性。在这项研究中，我们观察到，与来自 EBV 和大肠杆菌的抗原相比，TMEM161A 特异性 T 细胞对自身抗原 TMEM161A 的反应相对较弱。尽管反应性很弱，但此处提供的数据表明，TCR2 与 TMEM9-mer/A*02:01 配体的结合亲和力高于 LMP2 和 EntS。这表明在肿瘤中，TCR 结合与 T 细胞活化的解偶联可能是另一种机制，通过该机制，在肿瘤进展过程中抑制了针对 TAA 的特定反应的自然过程。这为为什么这些 T 细胞定位于 TMEM161A 过度表达但 EBV 和大肠杆菌可能不存在的肿瘤提供了可能的解释。对此，之前的报道表明，EBV在肺癌中很少检出，肺痰中也很少检出大肠杆菌。
以前，在肿瘤中发现的常见病原体特异性 T 细胞被认为是“bystanders”，而不是 TAA 特异性的。我们的数据显示 T 细胞对 TAA 的特异性和病原体来源的抗原并不相互排斥。此外，肿瘤中的这些病原体特异性 T 细胞表现出效应表型，而不是疲惫或压力状态，并且缺乏 CD39 表达。在这项研究中，我们描述了交叉反应性 T 细胞的例子，与交叉反应性微生物抗原相比，它们对共享的非突变肿瘤抗原的反应性较弱。尽管反应性较弱，但我们的数据表明，交叉反应性 T 细胞可能在抗 PD1 检查点阻断的情况下在控制癌症进展方面发挥作用。尽管尚不清楚这些交叉反应性 T 细胞在免疫检查点阻断所释放的抗肿瘤免疫反应中起什么作用，但人们很容易推测，接触交叉反应性微生物抗原可能会克服对非突变肿瘤或自身的耐受性-抗原。病原体可以作为免疫疗法基础的想法最初是从威廉·科利的工作中提出的，他在 19 世纪后期开创了一种名为 Coley 毒素的混合细菌疫苗，用于治疗癌症患者并取得了一些成功。最近，肠道微生物组已被证明是癌症免疫治疗反应的关键决定因素。在胰腺癌中，在术后存活时间最长的患者中观察到了一种独特的微生物组组成。识别肿瘤抗原和微生物抗原的交叉反应性 T 细胞也已被证明可以控制小鼠模型中的肿瘤生长。此外，最近显示 EBV 和流感可诱导针对共享 TAA 的抗肿瘤免疫。需要更多的研究来了解微生物/TAA 交叉反应性 T 细胞与免疫检查点阻断的临床益处之间是否存在因果关系。
总之，分析提供了一种资源，可以使用可应用于任何肿瘤类型的方法来全面表征来自大型 NSCLC 患者队列的 TCR。因此，我们将 178 名患者的近 800,000 个 TCR 序列减少到由三个或更多个体共享的超过 66,000 个特异性。在我们确定的 66,000 个特异性组中，然后我们将它们细分为 435 个在肿瘤与相邻肺中富集的特异性。这个数字可能代表的抗原数量要少得多，因为给定的肽-MHC 配体可以引发五个或更多不同的特异性组。我们发现了非突变的肿瘤抗原和病原体之间有趣的交叉反应性，这可以解释最近描述名义上病毒特异性 T 细胞浸润肿瘤的令人费解的结果，这意味着，正如这里提供的其他数据一样，这种交叉反应性可能是常见的现象。这增加了对这些致病表位的记忆 T 细胞可能引发针对癌症的交叉反应的前景。也许在瘤形成的早期阶段，碰巧过度表达与来自 EBV 的类似抗原发生交叉反应的自身抗原（突变或非突变）的癌前细胞与这些 T 细胞相互作用，从而形成慢性、低度炎症的肿瘤微环境.为了支持这一点，我们观察到交叉反应性 T 细胞表达高水平的颗粒酶 K，这在炎症性疾病和衰老的背景下已有报道。由于已知炎症会促进肿瘤形成，因此这可能会促进某些细胞变成恶性的过程。
Method
Classification of TCRs and specificity groups
Annotation of specificity groups
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