IL-2在肿瘤免疫中的研究

Selective targeting of engineered T cells using orthogonal IL-2 cytokine-receptor complexes，if=37.205，Science. 2018 Mar 2;359(6379):1037-1042. doi: 10.1126/science.aar3246

背景

有两个关于IL-2的故事，一个是肿瘤研究中制作移植瘤的大鼠动物模型：NOD/SCID/IL2γ null mouse，其中将大鼠X染色体上的IL-2受体的γ链双敲除，该基因敲除之后，大鼠免疫力严重降低，成为制作移植瘤成功率最高的动物模型。另外一个是，肝脏移植术中使用舒莱预防急性排斥反应，舒莱又称巴利惜单抗，其针对的抗原是CD25，而CD25蛋白是IL-2受体的组成部分。急性排斥反应是T细胞介导的细胞免疫反应，IL-2作用于T细胞表面的IL-2R，可以促进T细胞的活化增殖，增强细胞免疫的杀伤作用。舒莱可以阻断IL-2R，抑制T细胞的活化增生，从而抑制急性排斥反应。本研究是IL-2在增强肿瘤免疫中的作用的应用。

另外本研究是关于CAR-T肿瘤免疫治疗的内容。chemeric antigen receptor T cell immunotherapy嵌合抗原受体T细胞免疫治疗，简单来说，将肿瘤患者的T细胞提取，体外通过基因工程改造，使得T细胞表面表达肿瘤相关抗原受体，然后再回输至患者体内，这些T细胞将识别肿瘤细胞，发挥细胞免疫杀伤作用。第一代CAR-T由于主要问题是：回输入体内后，不久CAR-T就逐渐死亡或凋亡消耗掉了，治疗持续时间短。于是有人想法在T细胞表面加入一些共刺激因子，让其在体内可以接受刺激，促进其活化增殖，以便提供持续动力。其中包括IL-2R，就是一类共刺激分子，可以增强CAR-T的存活和功能。但是IL-2作用比较广泛，CAR-T和IL-2共同输入，副反应太大。本研究即解决上述矛盾。

本研究的科学假设：同时改造CAR-T的共刺激受体IL-2R和输入的IL-2，使得只有改造的IL-2和CAR-T的IL-2R结合，而不与体内其他细胞表面的IL-2R结合，也就不会产生相关副作用了。

如何设计实验

肯定得需要动物模型实验，制作移植瘤模型，给予CAR-T免疫治疗，然后分成两组，分别给予普通IL-2和orthognal IL-2，观察评价治疗疗效、副反应。疗效评价可以选用瘤体大小、肿瘤生长等指标。IL-2辅助免疫治疗的副反应如何评价？需要知道我们临床常见的副反应是什么，根据不良反应再来选择检测指标。

除了动物模型的表象功能之外，尚需要深入的分子互作研究。普通IL-2的分子互作机制什么？基因工程改造之后的orthognal IL-2能否与IL-2R结合，如何评价？orthognal IL-2和其他作用细胞共培养，检测哪些常规细胞因子，评价其不能引起相关副作用？

1、IL-2在体内的活性如何评估？

Stimulation of orthoIL-2Rb T cells (fig. S5B) with orthoIL-2 1G12 resulted in dose-dependent phosphorylation of STAT5 (pSTAT5), a hallmark of IL-2R signaling, with potency similar to that of wild-type IL-2, but also induced pSTAT5 on wild-type T cells, albeit with significantly reduced potency relative to IL-2。

The transcriptionfactor STAT5 is phosphorylated uponIL-2 engagement with the IL-2R and translocatesto the nucleus, where it promotes the proliferationand cell cycle progression of T cells。

IL-2 is indispensable for the development andfunction of regulatory T cells (Tregs) (12), whichare sensitive to IL-2 as a result of constitutiveexpression of CD25 and require IL-2Rb–dependentactivation of STAT5 signaling for survival andfunction (13)

IL-2刺激T细胞表面的IL-2Rβ，经过信号传导，引起细胞内STAT5的磷酸化，通过检测pSTAT5的表达水平，评估IL-2的生物学功能强弱。

经过突变途径，筛选出1G12和3A10两个突变体，具有和orthoIL-2R结合的功能，进一步验证他两能否刺激激活ortho T细胞和WT t细胞。其中3A10可以激活ortho T细胞，而不激活WT T细胞。

体外实验如何检测IL-2对CD8+ T细胞的作用

 We explored the in vitro activity of orthoIL-2 on activated primary mouse CD8+ T cells engineered to express the orthoIL-2Rb and a yellow fluorescent protein (YFP) to distinguish modified (YFP+) andunmodified(YFP–) cells。

IL-2和CD8+T细胞表面的IL-2R结合后，刺激细胞内转录因子STAT5磷酸化，激活下游通路，刺激细胞增生和细胞周期的前进。野生型IL-2、改装orthoIL-2（1G12和3A10）分别对野生型CD8+ T和改装orthoIL-2β的CD8+ T细胞作用，验证改装的orthoIL-2只对改装的T细胞有作用，而对野生型无作用。

3个因子作用于两种细胞，分别从STAT5的磷酸化、细胞生长两方面评价IL-2的功能作用。EC50为半数有效浓度。改装的IL-2 1G12可以同时刺激野生型和改装型，但是3A10至刺激改装型细胞。

动物实验如何评估IL-2功能，它对机体免疫功能又什么影响（副作用）

 we determined the in vivo activity of orthoIL-2 and orthoIL-2Rb T cells in mice with intact immune systems.

制作黑色素瘤的动物模型（本部分主要探讨IL-2治疗的副作用，所以没有制作肿瘤动物模型，而是选用的品系稳定的BL6小鼠模型），分别过继输入野生型CD8+T和改装orthoIL-2Rβ的CD8+T细胞（论文中为mixture of wild-type and orthoIL-2Rβ CD8+ T cells），然后分别输入IL-2和ortho IL-2，观察两种IL-2分别对两种过继CD8+ T的影响。

动物模型，C57/BL6小鼠属于近交品系，品系稳定和易于繁殖。从Thy1.1从提取CD8+ T细胞，然后过继输注于Thy1.2，输注细胞为mixture。之后的0-4天，每天给予两次IL-2或orthoIL-2，第5天取小鼠的脾脏血。

5天后取受体脾脏血液，评价受体中存活的供体CD8+ T细胞数量。发现常规IL-2和野生型CD8+ T细胞在过继后很快消耗，而改装过的ortho IL-2和ortho IL-2Rβ组，可以维持CD8+T数量在一个高水平。

B图中 横坐标ortho表示ortho IL-2R β的CD8+ T细胞，wild-type表示未经改装的CD8+ T细胞。经过IL-2刺激之后，过继的CD8+ T能维持在较高水平。

评价IL-2对机体免疫功能的影响，可以检测受体小鼠脾脏重量以及脾脏内CD8+ memory phenotype T cell、CD4+ Treg、和NK细胞数量的变化。CD8+ MP（ CD44+CD62L+）、CD4 Treg（CD25+Foxp3+）、NK （(CD3-NK1.1+CD49b+）。发现注射野生IL-2，对机体免疫功能影响很大。

外源性IL-2对小鼠免疫功能的影响，发现注射常规IL-2后，小鼠脾脏增大、CD8+ MP、CD4 Treg和NK细胞活性都增强，导致机体的各种副反应。而注射改装后的orthoIL-2，对小鼠体内三种细胞数量无明显影响。H图为典型流式图，上图为NK细胞，下图为CD4 Treg。

检测受体小鼠体内IFN、IL-5、血小板计数；同样反应IL-2对机体的影响；另外从宏观水平上，可以观察注射IL-2之后小鼠生存率、体重变化等方面评价IL-2的疗效。

MSA：mouse serum albimin小鼠血清白蛋白，将IL-2和小鼠白蛋白结合注射后，IL-2的半衰期更长。所有上述图表都反映出：常规IL-2注射后，小鼠死亡率增加、体重下降、血小板减少、IFN和IL-5产生增多。而改造的ortho IL-2则不会诱发那么多副反应。

动物模型证实，改装的orthoIL-2/IL-2Rβ具有治疗作用

上一部分是证实传统IL-2注射后，对机体的副反应很大，用于临床患者不能耐受IL-2诱导的副反应，而作者改装的orthoIL-2/IL-2β则不会诱导副反应。本部分需要证实改装的orthoIL-2具有抗肿瘤效应。需要制作黑色素瘤的动物模型（B6-F10 mouse model of melanoma，B6-F10黑色素瘤细胞皮下注射C57BL/6J小鼠）。

首先评价过继T细胞分泌IFN-γ和细胞表面PD-1/TIM-3的表达水平变化，因为能分泌IFN-γ的过继T细胞更具杀伤力，而PD-1和TIM-3与过继T细胞的杀伤力呈反比。可以发现改装orthoIL-2可以刺激过继T细胞分泌IFN-γ，而不明显提高TIM-3的表达。

给予IL-2后，过继T细胞表面IFN-γ增多，杀伤力增强。但是IL-2同样升高免疫刹车蛋白PD-1和TIM-3的表达。但是改装的orthoIL-2则不导师免疫刹车TIM-3的高表达，说明它不抑制免疫杀伤。

宏观水平，从移植瘤生长速度和移植瘤小鼠生存率两个指标观察治疗疗效。

传统过继T细胞+IL-2治疗肿瘤生长快、死亡率高。而使用改装orthoIL-2或者双改装，肿瘤生长更慢，小鼠死亡率较低。治疗效果好。

过继T细胞的制作问题

本论文最后一部分，是针对过继T细胞对黑色素瘤治疗疗效的评价。那么如何产生针对黑色素留的过继T细胞呢？

Transgenic pmel-1 T cell receptor (TCR) cells (pmel-1 T cells) express a high-affinity TCR that recognizes the B16-F10 specific ortholog of human gp100 (19), a self antigen overexpressed in human melanoma。

黑色素瘤表达gp100抗原，制作识别pmel-1的TCR的CD8+ T细胞，可以识别黑色素瘤细胞，进而杀灭瘤细胞。B16-F10是小鼠黑色素瘤细胞系，可以皮下种植与C57BL/6J小鼠形成移植瘤。orthoIL-2Rβ pmel1 transgenic CD8+ Tcells：利用转基因制作的针对B6-F10黑色素瘤细胞抗原gp100的TCR 杀伤T细胞。