病毒包装-腺相关病毒

不同病毒比较

LV-ADV-AAV比较

滴度

• 慢病毒：TU/ml
• 腺病毒：PFU/ml
• 腺相关病毒：vp/ml

AAV

AAV是一种单链DNA病毒，属于细小病毒科，Dependoparvovirus属。它的生命周期依赖于辅助病毒的存在，例如AdV。AAV存在于多种脊椎动物中，包括人类和非人类灵长类动物(NHP)。目前的共识认为AAV不会引起任何人类疾病。
它由直径约26nm的二十面体蛋白质衣壳和~4.7 kb的单链DNA基因组组成。衣壳包含三种类型的亚基VP1、VP2和VP3，总共60种拷贝，比例为1:1:10 (VP1:VP2:VP3)。基因组的两端是两个T形反向末端重复序列(ITR)，这两个ITR是AAV的DNA自我复制的起点以及触发病毒包装的信号，在病毒的复制和包装过程中起着关键作用，并且参与了病毒基因组在宿主基因组上的整合和逃逸过程。

AAV和AAV载体示意图

ITR序列示意图

腺相关病毒包装：

• 腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）是一类无法自主复制的二十面体微小病毒。通常情况下，只有在辅助病毒的参与下，才能进行复制。腺相关病毒（AAV）载体系统是对腺相关病毒进行优化的一种基因传递系统。AAV重组载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞，包装成病毒颗粒。纯化后，转导进入宿主细胞，线性双链DNA基因组以游离DNA的形式存在于细胞核中。辅助质粒能够代替辅助病毒，帮助AVV实现自我复制，从而提高载体系统的生物安全性。

几个关键问题：

• 克隆的容量在2.8kb左右（因为本身基因组仅4.7kb，还要加上基本元件）
• 但是AAV的滴度较高，可以达到13次方。
• 血清型：即为抗血清的类型，不同的AAV血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构，因而其识别与结合的细胞表面受体不同，这也导致不同血清型AAV感染效率/组织亲嗜性/表达时间不同
• 自互补AAV（self-complementary AAV）经过ITR改造，不必像传统单链AAV经过基因组的第二链合成才能启动基因的转录，在多种靶向组织中表现出快速、高效、长期的表达。

1. 优势：表达速度快；表达效率高；
2. 局限： 载体容量小，仅为rAAV的一半；纯度问题；

目前研究的腺相关病毒都是重组的腺相关病毒（rAAV）,主要是利用AAV2型基因组与不同血清型衣壳蛋白进行组装，以进一步确保AAV的安全性。
你只需要三个质粒就可以开始制作 AAV：

1. 包含结构和包装基因的包装质粒，
2. 包含病毒复制所需蛋白质的腺病毒辅助质粒，

3. 以及包含病毒基因组的转移质粒。

   
   
   图 1：AAV 转移质粒的部分。绿色部分是 AAV 质粒的关键元素。以灰色显示的部分是可选的顺式调节元件

• 反向末端重复 (ITR) 序列
  反向末端重复序列 (ITR) 使 AAV 转移质粒成为 AAV 转移质粒。ITR 序列各有 145 个碱基，AAV 质粒有两个 ITR 序列。ITR 之间的 DNA 序列被包装到 AAV 分子中。ITR 之外的内容不会打包到 AAV 向量中。ITR 之间的克隆容量约为 4.4 kb。由于其二级结构、回文性质和高 GC 含量，ITR 本质上是不稳定的。这种不稳定性会导致在常规质粒传播过程中 ITR 部分丢失，完全 ITR 丢失会取消 AAV 包装。为了防止 ITR 丢失，最好在缺乏重组的细菌菌株（如 Stbl3s）中传播 AAV 构建体。ITR 丢失可以通过使用酶（如 SmaI）的限制性消化来检测，这些酶在 ITR 中具有识别位点。由于其二级结构和高 GC 含量，常规 Sanger 测序通常无法通过 ITR 进行测序，但一些公司现在提供 Sanger 测序条件，可以读取这个具有挑战性的序列。
• Transgene:转基因是将由 AAV 传递的基因。在质粒图谱上，其序列位于 ITR 之间。只要大约 4.4 kb 或更小，它可以是您喜欢的任何内容。一些例子包括像 GFP 这样的报告基因、一些较小的 CRISPR-Cas 蛋白（如[SaCas9]、CRISPR gRNA）或您感兴趣的基因。
• 顺式作用元件：
  • Lox sites:Lox 位点与 Cre 重组酶结合使用，可在空间和时间上控制转基因表达。Lox 位点是定向的 34 bp 序列，可以位于转基因两侧并位于 ITR 之间。转移质粒通常有两对 lox 位点，它们是称为[FLEX]或 DIO的双 lox 系统的一部分。Lox 位点被重组酶 Cre 识别。酶Cre第一FL IPS第一对lox位点，然后之间的序列前CISE第二对之间的序列。最终结果是永久翻转的转基因。通过限制 Cre 的可用性，lox 位点让研究人员可以控制转基因的空间和时间激活。
  • WPRE：土拨鼠肝炎病毒 (WHP) 转录后调节元件 (WPRE) 在转录时形成三级结构，有助于 mRNA 的核输出并有助于增加转基因的表达。WPRE 位于 AAV 基因组的末端，就在最终 ITR 的上游。
  • Poly A:聚腺苷酸化或 polyA 信号有助于 RNA 和 RNA 翻译的核输出，并促进 RNA 转录本的寿命。polyA 位于 AAV 基因组的末端，就在最终 ITR 的上游和 WPRE 的下游。

引用知乎-马小苏-控制元件如启动子

引用知乎-马小苏

图片来源：Semantic Scholar

image.png

https://blog.addgene.org/viral-vectors-101-parts-of-the-aav-transfer-plasmid(网站也有生动形象的视频讲解)