第5章：抗体-抗原相互作用2021-04-16

抗原抗体相互作用

导 读

上图说明了本章的主题，它描述了抗体如何与几乎有无限种形状的抗原相互作用，以及这种相互作用如何保护我们免受病原体的侵袭。本章还回顾了抗原或抗体存在的非常特异的诊断试验的发展。抗体-抗原相互作用的最显著的特征是它们的特异性和亲和力。除此之外，抗体-抗原的相互作用很像其他受体-配体的相互作用。抗体与抗原之间的相互作用涉及物理化学力，类似于酶与其底物(或竞争性抑制剂)之间的相互作用，或受体(如胰岛素受体)与配体(如胰岛素)之间的相互作用。这些力来源于四个方面：(1)带电侧链之间的静电相互作用，(2)氢键，(3)范德华力，(4)疏水相互作用。
当抗原和抗体之间存在很好的匹配性时，这些典型的弱的、非共价相互作用的总和可以是相对较强的相互作用，并且该抗体被描述为具有高亲和力。
抗体非凡的特异性和亲和力使其在诊断测试中被广泛使用。本章的后半部分描述了抗体-抗原相互作用在诊断疾病中的几个最重要的应用。

抗体的抗原结合位点

许多实验方法已经被用来确定抗原-抗体结合位点的结构。到目前为止，最详细和最有价值的信息来自抗原-抗体复合物的X射线晶体学研究。通过对几种抗原-抗体复合物的三维结构的分析，得出的一个结论是，抗原结合位点的大小和形状可以有很大的不同。例如，结合部位可以是一个长而浅的缝隙，也可以是一个更宽、更开放的裂缝型结构(Fig 5.1)。对于小分子化合物，抗体上结合抗原的部位类似于酶活性部位。识别完整的较大蛋白质分子的抗体，它是针对表位的，抗原表位是蛋白质抗原的一部分-即抗体的结合位点-可能是突出的表面，而不是裂隙或缝隙(见Fig 5.1)。在所有情况下，抗原残基和抗体结合位点残基之间存在化学互补性。结合位点的壁由重链和轻链(VH和VL)的可变区(VH和VL)的氨基酸残基形成，称为高变区(HV区；见第6章)。抗体特异性源于抗原中的化学基团与抗体分子抗原结合位点上的化学基团之间的精确分子互补产生的。

Fig 5.1 抗原结合位点的大小和形状因其结合的分子或表位的类型而异

交叉反应性
一种抗体偶尔会与一种以上的抗原结合，这称为交叉反应或多特异性。该抗体是抗原1的特异性抗体，但与另一个分子抗原2，足以产生稳定的结合作用(Fig 5.2)。交叉反应的发生是因为抗原和抗体之间存在足够数量的化学相互作用，以创建一个稳定的结构，而不考虑总的“拟合优度”。值得注意的是，交叉反应可能会产生临床后果(BOX 5.1)。

Fig 5.2 抗体交叉反应示意图

抗体或抗原的诊断试验

几种常规使用的诊断试验是基于抗体的特异性和高亲和力。本章的其余部分提供了如何进行不同测试的示例，并描述了每种测试的一般原则：这些检测既有定性，也有定量，有助于确定抗原或抗体的存在。

酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)是一种非常敏感和简单的检测，它使用与抗体相连的酶的共价复合物直接检测抗原或与抗体-抗原复合物结合(Fig 5.3)。这项实验使用的是塑料板，将相关抗原绑定在“孔”的内部。患者血清在这些孔中孵育，任何相关抗体随后都会与抗原结合。对含有无关抗体的血清进行清洗，但由于其高亲和力，与抗原结合的抗体不会受到干扰。最后，加入从动物中提取的能与酶结合的第二种抗体，将其与患者抗体结合。这种抗人免疫球蛋白将与孔中仍然存在的抗体结合。所选的酶能够催化反应，从无色底物(如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶[HRP]；见Fig 5.3)生成有色产物。然后，与抗原结合的抗体的量与可以看到的有色最终产物的量成正比。BOX 5.2显示了如何使用ELISA来筛查传染病。

Fig 5.3 酶联免疫吸附试验(ELISA) 侧向流动试验

侧向流动试验

侧向流动试验是一种确定体液中是否存在蛋白质、抗原或抗体的简单测试。它与ELISA检测有一些相似之处，但经过精心设计，使用起来非常简单，不需要任何特殊设备，而且相对便宜。广泛使用在妊娠试验，它确认孕妇尿液中是否存在人绒毛膜促性腺激素(HCG)。
验孕棒是由一种具有吸收性的纸质材料制成的。放置在试棒一端的尿样将通过毛细管作用被吸引，并在沿试条的过程中遇到不同的试剂(Fig 5.4)。第一种试剂是与抗hCG表位的彩色微珠相连的小鼠抗体，当尿液第一次滴在验孕棒上时与之混合，如果有hCG存在，尿液就成为hCG-抗体-微珠复合物的一部分。虽然这些都是分散的，但这些复合体仍然是看不见的，并继续沿验孕棒流动。

Fig 5.4 妊娠棒检测呈阳性的事件顺序

接下来，尿液抗体混合物到达一个区域，在该区域，针对不同hCG表位的第二抗体已经固定在纸上。该抗体将结合并捕获任何hCG-抗体-珠状复合物。如果有足够的hCG，珠粒聚集的地方会形成一条彩色的线条。
怀孕测试需要包括一个对照，以表明测试情况令人满意。例如，必须确保尿液沿着验孕棒流动，以及抗体珠复合物的存在。在这个例子中，尿液接下来会遇到羊体内产生的第三种抗体的区域，该抗体是针对小鼠免疫球蛋白的。这将捕获最后几个珠子，并将产生一条控制线，表示测试成功。
Fig 5.5显示了怀孕测试的阳性和阴性结果，以及未通过的检测(例如，当使用的尿液不足时)。

Fig 5.5 A、双线阳性妊娠试验；B、单行阴性试验；C、测试失败，无线

免疫荧光

免疫荧光使用的是荧光化合物(荧光素)共价连接的抗体。免疫学家广泛使用的一种荧光化合物是异硫氰酸荧光素(FITC)，它与蛋白质上的游离氨基偶联。当FITC暴露在紫外线(UV)下时会发出绿色光。安装紫外线光源的荧光显微镜被用来检查暴露在荧光抗体中的样本。这项检测广泛用于检测细胞或组织切片中的抗原。它还用于筛选细胞或组织抗原的自身抗体(第28章)。要么测试抗体直接连接到荧光化合物(直接检测)，要么可以识别抗体的配体连接到荧光化合物(间接检测；Fig 5.6)。通常，荧光配体是针对检测抗体(如山羊抗人免疫球蛋白)所特有的第二种抗体。BOX 5.2提供了间接免疫荧光分析的临床应用实例。

Fig 5.6 使用异硫氰酸荧光素(FITC)进行直接(A)和间接(B)免疫荧光。其他荧光染料可以与不同的颜色一起使用

流式细胞术

流式细胞术是一种用计数表达抗原的细胞的技术。这些细胞被细胞表面抗原特异性抗体染色。抗体被偶联到特定的荧光试剂，如FITC(还有其他几种不同颜色的荧光可供选择)，然后通过流式细胞仪。染色细胞的数量可以计数，例如CD4+T细胞的数量(Fig 5.7；另一个例子见第35章)。

Fig 5.7 流式细胞仪“散点图”

BOX 5.1 药物过敏-免疫球蛋白E交叉反应

一名58岁的妇女被诊断出患有肺炎，急需抗生素。约20年前，医生给她开了青霉素治疗喉咙痛，在她服用第一粒胶囊后的30分钟内，她出现广泛的皮疹，呼吸困难，休克。她的主治医生认为可能是青霉素过敏发作。医生知道，青霉素过敏的人不应该再接受青霉素治疗，并且对β-内酰胺类的其他抗生素，如一些头孢菌素和碳青霉烯类也会有大约5%到10%的反应风险。他决定用红霉素治疗病人，红霉素的分子结构和青霉素非常不同。病人对这种抗生素反应良好，没有副作用。
药物的不良免疫反应，特别是抗生素，可能是一个重大的医学问题。青霉素可以与自身蛋白形成半抗原载体结合物，然后作为免疫原产生免疫球蛋白E(IgE)抗体。不幸的是，抗青霉素IgE抗体也会与其他一些抗生素发生交叉反应。这可能会使这些患者的细菌感染治疗复杂化，因为他们无法服用对抗感染所需的抗生素。
青霉素是一种β-内酰胺类抗生素，之所以这样命名，是因为它含有四元β-内酰胺环结构，如Fig 5.3所示。一些抗青霉素IgE抗体可以与其他结构相似的抗生素反应。具体的特异性可能会有所不同，但有足够的“适合度”(交叉反应性)可以显著结合这些其他的抗生素，并造成治疗问题(Fig 5.8)。

Fig 5.8 青霉素及其相关抗生素的结构。黄色的是β-内酰胺环

BOX 5.2 传染病的筛查

筛查献血者是否患有可能通过血液传播的传染病，筛查的其中一个目的是判断他们是否有感染这些传染病的风险，如果有那么就会被排除。一个例子是男性之间发生性行为，在一些国家这一群体可能因为感染艾滋病毒、梅毒或病毒性肝炎的风险较大而被排除在外。还会进行血液测试，以排除感染风险。这些测试检测在感染或接种疫苗后产生的针对病原体的抗体，就像乙肝病毒一样。
Fig 5.9显示了梅毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)筛查试验。ELISA试板包含两个对照孔和94个潜在献血者的样本。第一个孔是用一名梅毒患者的血清进行阳性对照。第二个孔含有从未患过梅毒的人的血清，这是一种阴性对照。这两个控件合并在一起是为了确保测试更加准确。另一个孔显示为黄色，这表明结果是阳性的。

Fig 5.9 检测梅毒的酶联免疫吸附试验(ELISA)试验中用于检测94份血液样本板

BOX 5.2 传染病的筛查-续

梅毒是由梅毒螺旋体的细菌引起的传染病。它的传播途径有性传播、子宫内传播和输血传播。这种筛查测试检测的是心磷脂的磷脂抗原的抗体，被称为性病研究实验室(VDRL)测试。虽然几乎所有的梅毒患者都会产生这些抗体，但它们也会由其他类型的感染或自身免疫者产生的。因此，VDRL检测梅毒是敏感的，但不是非常具有特异性。

为了确认潜在的献血者是否真的患有梅毒，该血清被用于特定的免疫荧光测试。如果这个结果也是阳性的，就证实这位捐赠者确实患有梅毒，她的血液不能用于输血，她还会被转介治疗梅毒。

梅毒的特异性血清学检测
梅毒螺旋体引起梅毒。这种细菌是一种柔韧的螺旋杆(Fig 5.10)。为了获得如图所示的图像，进行了荧光梅毒抗体吸收试验(FTA-ABS)。试验血清首先被非致病性梅毒螺旋体吸收，以去除交叉反应抗体。然后，将吸收的试验血清与梅毒螺旋体在显微镜载玻片上反应，根据Fig 5.6中描述的间接免疫荧光法，在荧光显微镜下用异硫氰酸荧光素(FITC)偶联的抗人免疫球蛋白G(IgG)抗体检测任何与梅毒螺旋体结合的抗体。

Fig 5.10 荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验可见梅毒螺旋体

BOX 5.3 临床诊断实验室新技术--荧光微球免疫分析

一种被称为Luminex xMAP技术的新诊断测试方法，似乎非常有价值，特别是在小体积样本上进行多项测试时。这项技术利用了酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术两个方面。本质上，聚苯乙烯微球内部用两种荧光染料进行颜色编码，这两种染料可以在激光照射后检测到。通过混合不同的染料，最多100颗珠子中的每一颗都可以被赋予一个独特的身份(“光谱信号”)，这可以在流式细胞仪中检测到(参见Fig 5.7)。每颗珠子还可以涂上不同的化合物，如抗体、寡核苷酸和酶，这些化合物可以从测试样本中收集分子。通过使用带有不同颜色荧光报告标签的夹心法(如Fig 5.11所示)，可以用第二个激光测量化合物(例如，肝炎病毒抗体)的量。微球溶解在微滴定孔或试管中，并且多个珠子可以存在于单个容器中。每一颗珠子都可以用不同的反应物衍生化，一组100颗珠子可以分析多达100种不同的化合物。珠子在液体中被输送到分析仪中，并受到激光照射，很像流式细胞仪中的单个细胞(见Fig 5.7)。这项技术可以用来在很短的时间内从少量的样品中进行多项测试，称为多重测试。结果表明，该检测方法灵敏、特异，与ELISA等其他检测方法相比具有一定的优势。
下面是可以使用该测试的一个示例。一个病人在出国旅行后不久就出现了黄疸。病人声称在旅行期间没有高危行为史，然后他被要求检测肝炎病毒抗体。采集血液样本，血清用于检测甲型、乙型和丙型肝炎病毒抗体的存在。如图所示，患者血清中含有与表达甲型肝炎抗原的Luminex小球结合的抗体，而不是与表达乙型肝炎或丙型肝炎抗原的小球结合的抗体。患者接受甲型肝炎治疗，黄疸消退。
微球微珠检测的一个优点是能够同时检测多种反应物，例如一组病毒抗原或一组细胞因子。

Fig 5.11 基于荧光微球的肝炎病毒抗体免疫分析(Luminex xMAP技术)