RNA甲基化修饰m6A检测热门技术—MeRIP-seq

m6A甲基化是转录后调控中重要的表观遗传修饰方式,它普遍存在于病毒和真核生物中。MeRIP-seq(高通量测序法)作为m6A修饰的检测方法,其具有针对全基因组范围内检测m6A的存在;能够明确每个基因的修饰水平,进行组与组之间比较等优势。接下来就让小编带大家详细了解m6A和MeRIP-seq。

1.在介绍m6A之前,首先认识一下什么是转录后调控?

转录后调控(post-transcriptional control)是指在转录后水平(RNA)上对基因表达的调控,包括对真核生物基因的转录产物进行的一系列修饰和加工。

转录后调控具体主要体现在:

1)对mRNA前体hnRNA的剪接和加工;例如5’-端加帽、3’-端polyA尾、RNA修饰、RNA剪接。

2)mRNA由细胞核转至细胞质的过程及定位;

3)mRNA的稳定性、降解、翻译过程等多个环节进行的调控;

4)RNA编辑和RNA干扰等现象也属于转录后调控。

2.什么是m6A?

m6A甲基化修饰是指腺嘌呤的6号碳原子连接的氨基基团中的一个氢被甲基基团取代,在m6A甲基化过程中涉及的这3类重要的酶:

Writers,甲基化酶,催化m6A甲基化的发生;

Erasers,去甲基化酶:去除m6A甲基化的修饰;

Readers,m6A识别蛋白,识别m6A修饰位点。

如下图所示,m6A是动态可逆的。

Dominissini, D. et al.(2014)

3. m6A具有哪些生物学功能,以及应用的领域?

m6A具有调控可变剪切、调控mRNA出核转运、调控mRNA的选择性翻译和翻译速率、相分离以及与RNA的稳定性有关等功能。

m6A作为最常见的一种转录后修饰,介导了超过80%的RNA甲基化。其调控机制与生物学功能涉及各个领域:

医学:

1)癌症:肺癌、肝癌、等,研究的主要内容包括m6A修饰如何影响肿瘤的发生、增殖、转移、耐药等;

2)其它类疾病:心血管疾病,神经性疾病,代谢类疾病等;

3)胚胎发育等。

农学:

研究的物种有果蝇,斑马鱼,猪;拟南芥、玉米,水稻,番茄等。

4. MeRIP-seq的实验设计?

实验样本:

细胞、组织、提取后的总 RNA(限定有参基因组物种)。

实验分组:

细胞模型:实验组VS对照组,建议3:3

组织模型:正常组VS疾病组,建议5:5

组内对照:IP组VS input组*

注*:input组主要用于比较鉴定IP组的抗体特异性结合,是必备的组分

测序平台:NovaSeq

关键分析内容:

m6A的基本特征

特征一. Peak在基因元件的分布

特征二. reads在基因元件的分布

特征三. Peak关联基因的特征

5. MeRIP-seq的送样要求?

• 样本类型:细胞、组织、total RNA

• 样本要求:

➢人、大鼠、小鼠

常规MeRIP-seq:Dnase消化后RNA总量≥25μg,浓度≥100 ng/μg,RIN≥8;

➢非人非鼠物种

Dnase消化后RNA总量≥150μg,浓度≥100 ng/μg,RIN≥8。

注:

1)人、小鼠和大鼠可同时检测mRNA和lncRNA上的m6A修饰,非人非鼠物种(人、小鼠、大鼠以外的物种)只能检测mRNA上的m6A修饰;

2)尽量提供RNA样本;

3)如需公司进行RNA提取,请根据样本特性估算样本量,最终获得的RNA质量和总量以质检结果为准;

4)活体取样,剔除结缔组织以及其它非研究组织,用预冷的PBS漂洗,去除血液和杂质。体积较大的组织需切割成绿豆大小的小块。将组织放入事先标记好样本信息的RNAase-free管中(管子速冻后无法做标记),立即液氮速冻2min,-80℃保存。

6. MeRIP-seq建库测序流程?

MeRIP-seq技术包括MeRIP实验和测序两个部分。

流程图如下图所示:

每组MeRIP-seq由两种类型的样本组成,即immunoprecipitation(IP)样本和Input对照样本。RNA分子首先被片段化成约100-200nt的片段。通过抗m6A的特异性抗体,IP样本提供了甲基化RNA片段的无偏测量。同时,Input对照样本可反映基础RNA的丰度。通过建库、高通量测序和生物信息学分析,给出全转录组m6A的定位。

Fu, Y et al. (2014)

7. MeRIP-seq分析流程?

测序数据下机之后,我们就可以获得原始测序序列(Sequenced Reads),在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下,我们通过如下标准流程进行生物信息分析:

8. MeRIP-seq后续的实验验证?

MeRIP-qPCR:利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。建议结合基因表达RT-qPCR 、WB等验证手段一起进行试验结果验证。

9. m6A甲基化的研究思路?

典型的m6A研究的法则:

1)m6A测序前的预实验,检测RNA的m6A水平是否发生差异等;

2)m6A测序及转录组学挖掘差异基因;

3) 后期功能验证。

10. 相比其他m6A检测方法,MeRIP-seq具有哪些优势?

1、针对全基因组范围内检测m6A的存在;

2、m6A的检测结果检测到基因水平;

3、能够明确每个基因的修饰水平,进行组与组之间比较;

4、检测平台为测序仪,仪器限制低,通用性高,重复性好;

5、结果可以和其他组学联合分析,从多维度讲述机制机理故事;

6、实验操作简单,入门容易。

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