Broad Institute视频笔记 Introduction to High-throughput Sequencing Data

无意间发现了油管上有一个系列视频，是Broad Institute在去年发布的课程，这个课程主要是对GATK第4版进行的一个系统的介绍。所以我也是打算把这一个系列先学习一下，这样就可以对GATK有一个系统的理解了：

这个系列视频一共有17讲，当然我也不确定自己什么时候能学完，毕竟只有晚上才能抽出时间学一些~视频地址贴在下面了

视频地址：here，有条件的同学可以看一看~

该笔记是记录了这个系列视频的第二讲，因为第一讲实在是没什么内容。在第二讲中，主讲人主要是先对测序进行了一个简单的介绍，我觉得非常好，这样的开始很适合对基因组测序比较陌生的小白拿来学习，而不是一上来就是天书。

文库制备

首先第一步是从样品里提取DNA，如果你想从RNA开始，那么就要先做反转，使其成为cDNA。之后需要把DNA进行片段化，大小大约是300-1000bp。这时你要做出选择，是对整个基因组进行测序，还是只对其中一部分进行测序，比如只对外显子进行测序。第三步就是加上接头，随后进行PCR扩增。这时文库就构建好了。

测序

把制备好的文库加入到flowcell测序，一般都会有多个lanes。每一个lane是相互独立的。在lane里，都排列着很多的簇，这些簇是用来扩增文库的。也就是“桥”扩增。同时机器可以根据荧光信号分辨出是哪一种碱基，从而对文库进行测序。有的时候，在同一个lane里会进行多个样品的测序，这种情况下，我们需要给每一个DNA片段加上barcode，来区分这一段DNA是来自哪一个样品。每一个lane最终会产生1-10billions的reads。

测序原始数据

一般我们测序得到的文件是以fastq文件来储存的。fastq文件实际上就是一个文本文件。第一行文本就是每一条read的信息，一般包括：read的名称，read group，以及是哪个lane上产生的read，还有样品名称。第二行就是测序的序列了。第三行只有加号。第四行是这条序列的测序质量分数。

全基因组测序和全外显子测序

全基因组测序，是不经过任何的片段筛选，就是我们从样品里提取出DNA以后，都用来测序，这样测到的是基因组全部的区域。而外显子测序，显而易见，只对编码基因的区域进行测序。

下面这个图就是一个例子，你可以在IGV里直观的看到全基因组测序和全外显子测序的区别：

接下来是一些可能会遇到的问题，需要你在实验过程中注意：
有时在你的实验中，你的测序结果可能没有足够的覆盖度（实验材料不足，或者实验过程中的操作造成的），这种情况是很好辨别的。也可能有的时候你的数据里的reads会出现“嵌合现象”，也就是说一对Read，其中一条来自一条染色体，另一条来自另一条染色体。在IGV里，一部分的Reads很好的和基因组比对上，而另一些没有。在外显子测序中，reads可能分布的非常不均匀。

还有可能影响的因素是GC区域，因为GC的binding很强，需要很多的energy进行GC结合。举个例子，在拷贝数分析中，我们需要辨别某一段拷贝的变化是由于DNA复制引起的，还是像下面这个图中的蓝色区域标记的高GC含量引起的read分布不均引起的。

像下面这样的图就是说明你的DNA样品里有细菌污染：

其实感觉这个主讲人在前半段讲的还挺好，到了后半段感觉那个PPT不是自己做的一样，一直在嗯嗯啊啊、支支吾吾的。讲的也不是很清楚。不过咱们学习的过程就是取其精华去其糟粕的过程~之后会继续这个系列的学习。