相分离——目标蛋白引物设计（OE plasmid的构建）

瞬转目标蛋白DNA，使其在细胞中瞬时高表达，在荧光显微镜下观察是否会形成聚合物颗粒。

1 蛋白表达质粒构建

（1）将自己的目标蛋白们的CDS区的DNA序列导入primer 5 看里面存在哪些酶切位点，将没有出现的酶切位点，作为引物末端，而引物中间序列则为目标蛋白DNA序列的前19位，与后19位。

首先在NCBI protein中输入蛋白名称，找到蛋白序列后导出fasta CDS序列，

例：

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出现txt文档，就是蛋白的编码区的全部序列。

2 设计primer

将质粒序列，目标蛋白序列同时导入primer5然后查看质粒中含有的内切酶位点及其目标蛋白全序列中没有的位点作为引物设计的位点。

常见的额内切酶识别位点：

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当你设计好引物，添加上了内切酶识别序列，下一步或许是添加保护碱基了，可以参考：

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所以VDR的primer为：

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F:前面黑色字体为保护碱基+Cla1序列，后面19个碱基为VDR序列的前19个碱基。

R：前面黑色字体为保护碱基+Kpn1的序列，后面19个碱基为VDR最后19个碱基的反义链。

反向互补链网站：https://novopro.cn/tools/rev_comp.html

引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接。

（2）PCR扩增：

以人***细胞cDNA为模板，PCR扩增目的基因，在引物两端分别引入上述选好的酶切位点，1%琼脂糖凝胶回收目的基因DNA条带。

（3）载体和目标片段的限制性酶切：

质粒载体CMV和目的基因PCR产物的上述两种酶双酶切，酶切反应在37℃水浴反应2h；1%琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒酶切大片段和目的基因酶切片段。

（4）连接转化：

质粒酶切回收大片段与目的基因连接，连接反应在16℃反应12小时。取10ul连接产物与100ul DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置5min,加入预热至室温的700ul LB培养基， 37℃恒温摇床培养50min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

（5）挑取克隆提质粒验证：

挑取5个单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，300rpm，37℃恒温摇床培养过夜，对过夜的菌液进行扩增，选择阳性菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行测序验证。