CsWAKL08是甜橙中一种由病原菌诱导的细胞壁相关受体样激酶,通过活性氧控制和JA信号转导,赋予柑橘细菌性溃疡病抗性

实验过程及方法:

1.通过系统发育树先进行保守基序分析,确定WAKL的功能区。

2.通过定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)检测了21个CsWAKL基因在CBC敏感品种万金城和CBC抗性品种卡拉蒙定(接种后0~48h的表达。发现CsWAKL01和CsWAKL08在万金橙中无明显变化,在卡拉蒙定中持续上调,而CsWAKL20的表达谱正好相反。因此,推测CsWAKL基因可能是XCC抗性基因。

3. 为了探讨CsWAKL08在抗病相关信号转导中的作用,我们采用ABA、茉莉酸甲酯和水杨酸来诱导处理万金橙和卡拉蒙定,并通过qRT-PCR分析CsWAKL08的表达结果。发现用ABA处理,两种植物都无明显变化;用茉莉酸甲酯处理,卡拉蒙定中CsWAKL08的表达上调,万金橙中无明显变化;用水杨酸处理,两种植物中CsWAKL08的表达都上调。我们得出结论,在CBC抗性品种中,茉莉酸甲酯和水杨酸都能诱导CsWAKL08的表达,而在CBC敏感品种中CsWAKL08的表达可能是由外源基因诱导的,

4.为了确定CsWAKL08的亚细胞定位,用GFP融合蛋白分析,发现CsWAKL08定位于质膜,在细胞外信号接收中发挥作用。

5.通过构建了一个由CsWAKL08过表达的转基因植物,与对照溃疡病症状明显减轻。

6.为了确定CsWAKL08在CBC敏感植物中的作用,用RNA干扰技术除去CsWAKL08,将得到的转基因植物进行定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)分析,发现去除CsWAKL08基因导致柑橘溃疡病更加严重。说明CsWAKL08对CBC抗性很重要。

7.为了研究CsWAKL08提高CBC抗性的机制,用商用试剂盒检测了O2、h2o2的浓度。发现CBC抗性植株h2o2水平高,O2水平低,而CBC敏感植株正好相反。通过分析POD和SOD的活性,发现CsWAKL08高表达植物中POD和SOD的活性都增加,而RNA沉默植物中活性都下降。说明活性氧水平与XCC抗性有关,CsWAKL08高表达植株增强了XCC感染对抗氧化酶的诱导。

8.测量了转基因和对照植株中SA和JA的含量。和诱导JA和SA生物合成的基因CsAOS和CsICS的转录水平。发现XCC感染后,XCC 抗性植物中JA含量升高,而XCC敏感植物中JA含量降低;SA无明显变化。说明CsWAKL08对 JA的积累具有正向调节作用。

9.通过对JA反应基因在这些转基因植物中的表达进行分析,发现JA的反应基因在CsWAKL08高表达植株中上调,在沉默植物中下调,说明CsWAKL08可以通过调控JA依赖信号激活JA反应来调控Xcc感染,从而赋予CBC抗性和耐受性。

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