16S rdna 菌种鉴定

一、为什么选择16S  rdna进行菌种鉴定：

      细菌的rRNA是细胞内含量最多的RNA，约占RNA总量的80%以上，由高度保守区和可变区组成。

      细菌的rRNA包括5S、 16S、 23S，其中5S rRNA信息量少，不适合分析。23S rRNA尽管分子大，信息量多，但碱基突变速度较快，同样不适用于细菌鉴定。16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基rRNA（16S rRNA）的DNA序列，相比之下遗传较为稳定，长度在1500bp左右，代表信息量适中，可以用于研究系统进化。目前已经报道了10,000种以上的细菌16SrDNA序列。

二、16S rdna 菌种鉴定详细实验流程：

1.PCR扩增模板获取：

a.菌落热裂解液：挑去取单个菌落到无菌水中，沸水中孵育10min；涡旋震荡后短暂离心取1ul作为PCR模板（方便快捷，但产物不纯）

b.用常规的基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA（可以获得高质量的DNA模板）

2.PCR扩增（具体体系及程序根据用的PCRmix而定）及一代测序，所用引物如下：

2 7F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT

3.一代测序序列与数据库比对，确定细菌种属：

网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

a.打开NCBI网站，比点击网站底部"BLAST"项：

b.单击“Nucleotide BLAST ”

4.把测序得到的序列复制进左上方的搜索框内；

并把数据库选定为“rRNA/ITS databases”；

如下图标红部分：

5.点击页面左下方的“BLAST”选项：

6.比对的结果会根据符合度从高到低显示，如示例序列鉴定到的最符合的菌种为“Bacillus safensis”：

PS：如期项目手册走一波：