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SAM 是用来存储核苷酸序列比对信息的文件格式。SAM Tools 工具包提供各种工具处理SAM文件。包括功能：sorting, merging, indexing and generating alignments。安装教程见https://www.jianshu.com/p/53de170927a7
安装过程中有许多依赖的库需要安装的，可能每个人缺的库都不尽相同，不懂的就百度一下吧：
sudo apt-get update
sudo apt install gcc
sudo apt install git
sudo apt install make
sudo apt-get install libncurses5-dev ##bam_tview_curses.c:41:20: fatal error: curses.h: No such file or directory
sudo yum install bzip2-devel ##cram/cram_io.c:57:19: fatal error: bzlib.h: No such file or directory
sudo apt-get install liblzma-dev ##cram/cram_io.c:60:18: fatal error: lzma.h: No such file or directory
装好之后有如下这么多命令，下面我们只介绍samtools：
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rqq@ubuntu:~/bio$ samtools
Program: samtools (Tools for alignments in the SAM format)Version: 1.5 (using htslib 1.5)
Usage: samtools [options]
Commands: -- Indexing
dict create a sequence dictionary file
faidx index/extract FASTA
index index alignment
-- Editing
calmd recalculate MD/NM tags and '=' bases
fixmate fix mate information
reheader replace BAM header
rmdup remove PCR duplicates
targetcut cut fosmid regions (for fosmid pool only)
addreplacerg adds or replaces RG tags
-- File operations
collate shuffle and group alignments by name cat concatenate BAMs
merge merge sorted alignments
mpileup multi-way pileup sort sort alignment file
split splits a file by read group
quickcheck quickly check if SAM/BAM/CRAM file appears intact
fastq converts a BAM to a FASTQ
fasta converts a BAM to a FASTA
-- Statistics
bedcov read depth per BED region
depth compute the depth
flagstat simple stats
idxstats BAM index stats
phase phase heterozygotes
stats generate stats (former bamcheck) -- Viewing
flags explain BAM flags
tview text alignment viewer
view SAM<->BAM<->CRAM conversion
depad convert padded BAM to unpadded BAM
一、samtools view功能
1、将sam文件转化为bam文件
samtools view -bS in.sam > in.bam
是view的一个应用-b指定输出文件为bam, -S 指定输入文件为sam
2、查看bam文件的header信息
samtools view -H in.bam
3、取出bam文件的一部分
samtools view -b your.bam Chr1 > Chr1.bam
- -b 指定是输出文件为bam,
- Chr1指定你要看的是哪一部分， 这里指看Chr1那一部分，然后重定向到一个新的bam文件，注意，这个bam文件是没有header的，如果想要包括header 可以使用-h参数。
随机取出bam文件的某一部分出来， 必须要有index文件，否则会报错： [bam_index_load] fail to load BAM index. [main_samview] random alignment retrieval only works for indexed BAM files.
关于view更详细的参数说明：
Usage: samtools view [options] | [region1 [...]]
Options:
-b output BAM
-h print header for the SAM output
-H print header only (no alignments)
-S input is SAM
-u uncompressed BAM output (force -b)
-1 fast compression (force -b)
-x output FLAG in HEX (samtools-C specific)
-X output FLAG in string (samtools-C specific)
-c print only the count of matching records
-B collapse the backward CIGAR operation
-@ INT number of BAM compression threads [0]
-L FILE output alignments overlapping the input BED FILE [null]
-t FILE list of reference names and lengths (force -S) [null]
-T FILE reference sequence file (force -S) [null]
-o FILE output file name [stdout]
-R FILE list of read groups to be outputted [null]
-f INT required flag, 0 for unset [0]
-F INT filtering flag, 0 for unset [0]
-q INT minimum mapping quality [0]
-l STR only output reads in library STR [null]
-r STR only output reads in read group STR [null]
-s FLOAT fraction of templates to subsample; integer part as seed [-1]
-? longer help
4、bam文件 转化为sam文件
samtools view -h R12.merged.bam > test.sam
-h是将bam文件中的header也加入到sam文件中。 比如htseq-count老版本只接受sam文件
二、建立索引Indexing
注意
如果你执行命令的地方和参考序列不在同一个目录，参考序列用全路径，最后的
index结果和参考序列在同一个目录里面，而不是执行命令的目录。在fasta文件中，对于某一个序列，除了最后一行，其他行所含碱基数应该一样。
1、对fasta文件建立索引
samtools faidx ref.fasta`
2、对BAM文件建立索引
samtools index in.bam
- 结果文件名为in.bam.bai
3、知道位置信息查找对应的序列信息
samtools faidx ref.fa Chr1:33667-33667
指查看染色体一上的第33667个碱基。
三、将bam文件进行sort
只能对bam文件进行sort, 不能对sam文件。
samtools sort aln.bam anl.sorted
- 默认是根据coordinate进行sort， 如果输入bam文件为in.bam , 则输出文件名为in.sorted.bam
- 如果要按照read name进行sort, 需要加
-n, 如heseq-count 就要求文件时按照read name 而不是coordinate。
samtools sort -n aln.bam anl.sorted
四、去除bam文件中pcr导致的重复reads信息
samtools rmdup in.bam in.rmp.bam
五、合并bam文件
samtools merge out.bam in1.bam in2.bam in3.bam
假如in1.bam, in2.bam, in3.bam是某个某样本的三个重复，我们可以将他们合并为一个bam文件。
samtools merge -R chr1 out.bam in1.bam in2.bam in3.bam
如果想对部分合并，如至合并一号染色的上的bam文件合并，chr1必须为序列的名字，一号染色体序列的名字为Chr1，那么就应为-R Chr1
注意：要合并的bam文件，必须有对应的index文件。
samtools index in.bam #结果文件名为in.bam.bai
六、统计bam文件中的reads情况，有多少reads比对上
命令：
samtools flagstat RF12.merged.bam
结果如下：
66196754 + 0 in total (QC-passed reads + QC-failed reads)
#bam文件中所有的reads数。
0 + 0 duplicates
66196754 + 0 mapped (100.00%:-nan%)
#比对到基因组上的reads数目， 我用的比对软件是tophat， 结果中只保留比对上的reads信息。
66196754 + 0 paired in sequencing
#属于paired reads数目， 我的数据都是双端测序。所以都是paired reads。
33493586 + 0 read1
#来自于read1中的reads数目
32703168 + 0 read2
#来自于read2 中的reads数目
#read1 + read2 = paired reads
45729393 + 0 properly paired (69.08%:-nan%)
#完美匹配的reads数， 即一对reads比对到同一条参考序列，并且这对reads之间的举例符合设置的阈值
61118410 + 0 with itself and mate mapped
#一对reads 都比对到了参考序列上，但是不一定比对到同一条染色体
5078344 + 0 singletons (7.67%:-nan%)
#一对reads中，只有一条匹配到了参考序列上。
#61118410+5078344=66196754
703397 + 0 with mate mapped to a different chr
#一对reads比对到了不同的染色体上。针对的是with itself and mate mapped
346693 + 0 with mate mapped to a different chr (mapQ>=5)
#和上面一样，只不过比对的质量大于等于5的reads数目