杀杀
还是神经退行性疾病的文献总结~
TBK1 Suppresses RIPK1-Driven Apoptosis and Inflammation during Development and in Aging
TBK1在发育和衰老过程中抑制RIPK1驱动的细胞凋亡和炎症
衰老是遗传性和偶发性神经退行性疾病的主要危险因素。但是，尚不清楚衰老如何与遗传易感性相互作用以促进神经退行性变。文章研究了TBK1的部分功能丧失，这是肌萎缩性侧索硬化症（ALS）和额颞痴呆（FTD）合并症的主要遗传原因，如何导致年龄依赖性神经变性。
长期以来，坏死(Necrosis)被认为是在恶劣环境下细胞的被动死亡方式，而哺乳动物细胞的程序性死亡除通过凋亡(Apoptosis)通路以外，还可借由程序性坏死(Necroptosis)途径发生。
这篇文章主要借由两种神经退行性疾病进行研究：
肌萎缩侧索硬化症（ALS）主要导致运动神经元变性、肌肉萎缩；
额颞叶痴呆（FTD）临床特征是行为异常、语言功能障碍、额叶颞叶逐渐退化；
这两种相关的疾病具有共同的遗传易感特征。普遍病理学特征：活化的小胶质细胞；并且平均发病年龄在50~65岁之间，具有突变的个体可能无症状地生活到中年；
衰老是遗传性、偶发性神经退行性疾病的主要危险因素，目前尚不清楚它与遗传因素的相互作用。介导细胞程序性坏死的因素有哪些还在深入研究中，目前的研究现状：
程序性坏死与小胶质细胞介导的神经炎症增加有关
RIPK1 (Receptor-interacting protein kinase 1）促进神经退行性疾病中小胶质细胞的活化，在介导神经炎症中起着核心作用；
TAK1 (TGF-β-activated kinase 1) 通过抑制性磷酸化，或者通过激活MK2和IkB两种激酶来抑制RIPK1的表达；
TAK1对RIPK1的抑制作用丧失，使细胞在受到TNF-α刺激后直接凋亡，也叫RDA (RIPK1-dependent apoptosis)；
RIPK1的激活导致RIPK3激活，进而使MLKL磷酸化，发生坏死性凋亡；其年龄依赖性激活导致人类中枢神经系统变性的分子机制仍不清楚；
尽管坏死已参与介导包括ALS，AD和MS在内的神经退行性疾病的病理学研究，RDA在介导这些疾病中的作用尚待揭示。
这篇文章主要研究了Tbk1基因以及RIPK1的相互作用，以及TBK1的降低如何促进成人中枢神经系统的炎症
1 RIPK1激酶活性的异常激活导致Tbk1 -/-小鼠的胚胎死亡
文章首先使用Tbk1基因杂合小鼠进行杂交，在总数相同的情况下，观察各种基因型的小鼠数量，第一列是根据孟德尔遗传定律推测的期望数，第三列是实际观察到的小鼠数量，可以发现tbk纯合和杂合子显示出1比2的比例，但是纯合缺失的小鼠数量为0，这说明TBK1纯合缺失的小鼠具有胚胎致死性。接下来文章引入了RIPK1D138N突变，这个突变可以让RIPK1激酶失活。最后我们可以观察到，只要引入了D138N突变的小鼠，无论杂合还是纯合，都可以存活，但是如果未引入使RIPK1失活的D138N突变，小鼠仍然具有胚胎致死性，这个结果说明TBK1缺失的小鼠的RIPK1激酶会激活，并导致小鼠胚胎致死。
2 Tbk1-/-小鼠严重肝变性，并观察到多种细胞凋亡标志，D138N突变导入可以完全阻断这些标志
文章对于TBK1缺失的小鼠胚胎进行了分析。首先在胚胎切片中观察到严重的肝变性，tunel分析也显示tbk1缺失的小鼠中发现了细胞凋亡的标志。同样的细胞凋亡标志还有caspase-3（CC3）一种细胞凋亡中非常关键的蛋白酶。但在tbk1未缺失的细胞，以及tbk1缺失，但引入了ripk激酶失活突变d138n的样本中显示正常。这个结果表明tbk1缺失的细胞会导致严重的细胞凋亡，但是如果使ripk1激酶失活就能够阻止凋亡。
3 Tbk1 -/-胎肝中促炎细胞因子和趋化因子的水平显著增加，但在Ripk1D138N导入的胚胎中维持正常
同样文章发现，跟tbk1未缺失的样本相比，tbk1缺失的胎肝中促炎细胞因子和趋化因子的水平增加，炎性因子的升高会引起多种凋亡或者衰竭表现。而同样导入使ripk1失活的突变后，这些因子都显示出正常水平。以上结果表明，Tbk1 -/-小鼠中，RIPK1激酶活性的异常激活会导致胚胎死亡，可能跟多种细胞凋亡因子或炎性因子的升高有关。当ripk1失活时凋亡被抑制。这种凋亡可以认为是ripk1依赖性的细胞凋亡
4 TBK1缺乏不仅使细胞对TNF-α诱导的凋亡敏感，而且将由TNF-α/ CHX诱导的RIA转化为RDA。
在得出初步的结论后，文章想要探讨TBK1缺乏是如何影响ripk1的激活，并导致ripk1依赖性凋亡的。文章使用了之前小鼠培养的永生化小鼠胚胎成纤维细胞MEF。图a中蓝线代表tbk1缺失后，使用tnfα诱导凋亡，可以看出细胞死亡比例高，当tbk1未缺乏的时候，细胞是可以抵抗tnfα诱导的凋亡的。Nec1s是一种ripk1激酶抑制剂。因此绿色线是在蓝线的情况下去使用ripk1激酶抑制剂，此时细胞也能够抵抗tnfα诱导的凋亡。图b的纵坐标是半胱天冬酶8，也是介导细胞凋亡的一种因子。同样我们可以发现只有在tbk1缺失并且使用tnfα诱导的红色柱子中caspase8的活性特别高。因此tbk1缺失后，细胞增加了对tnf-α诱导凋亡的敏感性。E图中的chx是一种诱导ripk1非依赖型凋亡的手段。从红线和黑线我们可以看出，tbk1尽管未缺失，但是细胞依然会死亡，因此tbk1的存在并不能阻止ripk1非依赖型的凋亡途径。但是在tbk1缺失的情况中，可以看出相比绿色线，加了ripk1抑制剂的橙色线的细胞死亡减少了很多，也就是当tbk1缺失时，我们是可以通过抑制ripk1活性来阻止细胞死亡，也就是此时凋亡已经转化为ripk1依赖性的了。5 RDA是依赖于RIPK1激酶活性的炎性细胞凋亡的一种形式。
另外，文章研究了在tnfα诱导下，野生型的mef和tbk1缺失的mef中细胞炎性因子和趋化因子的含量，发现tbk缺失会导致这些因子增加大于1.5倍，而抑制ripk1可以减少这些因子的含量，但敲除ripk3对其的抑制作用没有抑制ripk1有效。这个结果说明在tnfα诱导下，ripk1依赖性凋亡其实跟炎性细胞凋亡相关
6 关键下游事件：RIPK1和FADD相互作用形成复合物
Nec-1 s阻断了TNF-α在Tbk1 -/- MEFs中诱导的FADD和RIPK1的相互作用
7 TBK1可以通过磷酸化直接抑制RIPK1的活化
去磷酸化后，条带恢复
发现与TBK1共同孵育可显着降低RIPK1的激活，如p-RIPK1（S166）所示（图H）
8 RIPK1中的T189是TBK1介导的主要磷酸化位点
我们可以看出质谱分析发现人RIPK1中的T189是TBK1介导的主要磷酸化位点
上图是一个蛋白结构，灰色是PKC也就是蛋白激酶C，蓝色是RIP1的结构，可以看到蓝色和灰色的结构高度重合，并且RIPK1的催化环中的D138残基和在激活环中的T189残基分别与PKC催化环中的D368和激活环中的T406占据相似的位置。PKC中的T406由于其在激活环中的位置而直接参与了激酶的底物识别，因此文章假设T189也可能直接参与底物结合。并设计了下面这个二聚体来验证。这个二聚体模型可诱导两个不同蛋白的结合。目的蛋白分别与DmrA和DmrC结合结构域融合，然后加入A/C异源二聚物配体（蓝色），诱导二聚化。
文章发现T189E和T189A RIPK1突变体均无催化活性
WT RIPK1的重新引入可以挽救Tbk1 -/-的敏感性。Ripk1 CrisprKO MEF对TNF-α诱导的RDA而言，T190A和T190E RIPK1均不能恢复这种敏感性。
重新引入WT RIPK1可以恢复Tbk1-/-; Ripk1CrisprKO MEF对TNF-α诱导的RDA的敏感性，但T190A和T190E RIPK1都不能恢复这种敏感性。
因此，TBK1对T190 / T189 RIPK1的磷酸化通过阻断RIPK1的反式激活而抑制了RIPK1。
文章内容也很多，第一部分的结果作为导读，后续的研究大家可以去看看文献~
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6128749/