易基因： WGBS等揭示DNA甲基化调控林地草莓植株高度和果实大小的分子机制｜植物发育

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DNA甲基化影响基因组稳定性、转座子沉默和基因表达；它主要发生在对称CG和CHG以及不对称CHH (H = A, C或T)中的胞嘧啶上。RNA介导的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)通路调控植物中所有三种序列背景下的novo DNA甲基化。RdDM通路非常复杂，由许多蛋白质和非编码RNA组成。尽管RdDM是一种重要的表观遗传修饰通路，但其生物学作用和进化重要性仅局限于少数植物物种。在RdDM机制中，小基因家族DNA甲基化因子(FDM) 1-5及其参与De Novo 2 (IDN2)/RDM 12的同源物是重要的组成部分。

草莓是世界各地种植的一种受欢迎水果作物。栽培草莓属于八倍体物种Fragaria X ananassa。二倍体林地草莓Fragaria vesca（F. vesca）是栽培草莓的祖先种，是经常被用作基础研究的模式物种。在栽培草莓果实成熟过程中，由于RdDM活性降低，检测到整体DNA甲基化减少。然而，关于DNA甲基化对草莓其他性状的调控作用知之甚少。

2022年10月6日，华中农业大学园艺学院康春英教授团队以“Factor of DNA methylation 1 affects woodland strawberry plant stature and organ size via DNA methylation”为题在《Plant Physiology》杂志发表研究论文。该研究以林地草莓 (F. vesca)为对象，通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）的表观基因组和对应的转录组分析，揭示了DNA甲基化因子1（FDM1）通过调控CHH中的DNA甲基化，在启动子和3’-末端位点具有更强作用，并影响不同组织中的基因表达，改变DNA甲基化水平，从而影响林地草莓的植株高度和果实大小，表明了RdDM在草莓生长发育的关键调控作用。

标题：Factor of DNA methylation 1 affects woodland strawberry plant stature and organ size via DNA methylation （DNA甲基化因子1通过DNA甲基化影响林地草莓植株的生长和果实大小）

时间：2022-10-06

期刊：Plant Physiology

影响因子：IF 7.4 / 1区

技术平台：WGBS、RNA-seq、qRT-PCR分析等

研究摘要：

RNA介导的DNA甲基化（RdDM）是一种表观遗传学过程，RdDM将沉默导向特定的基因组区域和位点。RdDM生物学功能在园艺植物中没有得到深入研究。本研究在林地草莓（Fragaria vesca）分离了EMS（ethyl methane-sulfonate）诱导的（reduced organ size，ros）突变体，与野生型（WT）相比，ros突变体由于细胞数量减少，会产生小的叶片、花朵和果实。候选突变导致FvH4_6g28780中的过早终止密码子，该密码子与编码RdDM通路成分的拟南芥（Arabidopsis thaliana）DNA甲基化因子1（FDM1）具有高度相似性，被命名为FveFDM1。同样，CRISPR/Cas9产生的fvefdm1CR突变体也产生较小的果实。在拟南芥fdm1-1fdm2-1双突变体中过表达FveFDM1回复了RdDM靶位点的DNA甲基化。FveFDM1与De Novo 2（FveIDN2）中参与的同源物在蛋白质复合体中发挥作用。

全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）显示，fvefdm1的全基因组DNA甲基化显著减少，尤其在CHH中。与野生型(WT)组织相比，fvefdm1突变体的不同组织中鉴定出共有和特异性差异表达基因，验证了几种赤霉素（GA）生物合成和细胞周期基因的DNA甲基化和表达水平。与WT相比，fvefdm1幼叶中GA和生长素含量显著降低，且经外源GA和生长素处理也不能恢复fvefdml的果实器官大小。此外，GA处理大大诱导了FveFDM1、FveIDN2、核RNA聚合酶D1（FveNRPD1）、结构域重排甲基化酶2（FveDRM2）和细胞周期基因的表达水平。总之，本研究结果表明了FveFDM1通过RdDM介导的园艺作物DNA甲基化在植物生长和发育中的关键作用。

图形摘要：草莓中FveFDM1基因的功能模型

GA诱导FveFDM1和FveIDN2表达，FveFDM1/FveIDN2的蛋白复合体直接结合长RNA，与AGO4-siRNA一起影响靶位点的DNA甲基化水平。一些潜在的下游调控基因被DNA甲基化促进或抑制，通过干扰细胞分裂导致果实器官大小变化。

设计思路

结果图形

（1）F. vesca中的ros突变体在细胞增殖方面存在缺陷

图1：F. vesca 中ros突变体的表型特征。

1. WT野生型（F.vesca植株YW）和ros突变体植株。
2. WT野生型和ros突变体的叶片、开放的花朵和成熟的果实。在（A）和（B）中，对各个图像的数字提取以比较分析。
3. WT和ros的叶片表皮近轴侧图像。
4. 叶片表皮的同一区域的细胞数量和叶片面积。
5. WT和ros的花瓣表皮的差分干涉对比图像。
6. 在花瓣表皮的同一区域的花瓣面积和细胞数量。
7. WT和ros果实在髓中心7 DAP时的横截面图像。
8. 7 DAP时，果实髓同一区域的细胞数。

在D、F和H中，数据表示为平均值±标准偏差（SD）；n=6-15；**P＜0.01，学生t检验。比例尺：（A）2cm；（B）1cm；（C和G）100 μm；（E） 10 μm。

（2）ros突变体由FveFDM1中的点突变诱导

图2：ros致病基因FveFDM1及其同源物特征。

1. FveFDM1基因模型和ros致病突变示意图。粗条表示外显子，细条表示内含子。突变密码子有下划线。
2. FveFDM1的保守结构域和突变位点示意图。
3. FveFDM1及其同源物在草莓、拟南芥和水稻中的系统发育树。Bootstrap值来自1000个重复百分比。蓝点表示草莓基因。每个位点比例尺。
4. 基于RNA-seq reads的log2转化转录本，每M reads显示FveFDM1及其同源物在F.vesca不同组织中的表达水平热图。SAM，茎尖分生组织；FM，花分生组织；REM，花托分生组织；RG，F. vesca变种Ruegen；YW，F.vesca品种YW。
5. FveFDM1-GFP、FveIDN2-GFP和FveFDM2-GFP在N. benthamiana叶片中的亚细胞定位。比例尺：10 μm。

（3）CRISPR/Cas9敲除FveFDM1导致果实器官变小

图3：fvefdm1CR突变体的产生和表征。

1. FveFDM1中sgRNA靶位点示意图。原间隔区相邻motif（PAM）序列用红色表示。
2. T0代中的三个fvefdm1CR突变体（L1-3）和未经编辑的转化植物（WT）。
3. 在T0代中fvefdm1CR L1–3的sgRNA靶位点诱导突变。虚线表示敲除的核苷酸。插入的核苷酸用红色表示。所有测序克隆中每个等位基因比例在序列后面表示。
4. fvefdm1CR L1–3和WT的成熟叶片。
5. fvefdm1CR L1–3和WT的叶片大小。对单个图像进行数字提取以进行比较。
6. fvefdm1CR L1–3和WT叶片表皮近轴侧的图像。
7. fvefdm1CR L1–3和WT叶片表皮近轴侧的细胞数量和细胞大小。
8. FveFDM1在fvefdm1CR L1–3和WT幼叶中的表达水平。

数据为从三个生物学重复中获得的平均值±SD；*P＜0.05；**P＜0.01，学生t检验。比例尺：（B和D）2 cm；（F）100μm。

（4）FveFDM1在RdDM通路中起作用，并与FveIDN2直接互作

图4：FveFDM1可以回复拟南芥fdm1-1fdm2-1中的DNA甲基化水平，并与FveIDN2直接互作。

1. RT–qPCR检测FveFDM1在fdm1-1 fdm2-1和三个FveFDM1-ox转基因系（L8、L15和L16）中的表达水平。
2. WT、fdm1-1、fdm2-1和三个转基因系叶片中，通过HaeIII或McrBC和qPCR消化的chop PCR检测三个RdDM靶标AtSN1、IGN5和siR02的DNA甲基化水平。使用未消化的基因组DNA作为每个样品对照扩增。（A）和（B）中的数据从三个生物学重复中获得的平均值±SD；**P＜0.01，学生t检验。
3. 通过酵母双杂交分析检测FveFDM1、FveIDN2和FveFDM2之间的蛋白质互作。转化的酵母细胞在SD–Leu–Trp或SD–Leu-Trp–His–Ade培养基上生长。AD：激活域；BD：DNA结合域。使用空载体作为对照。
4. 利用分裂荧光素酶互补法检测N. benthamiana叶片中FveFDM1和FveIDN2之间的蛋白质互作。比例尺：2 cm.
5. Co-IP检测FveFDM1和FveIDN2之间的蛋白质互作。该蛋白在N.benthamiana叶片中瞬时表达。

（5）FveFDM1调控DNA甲基化

图5：fvefdm1花蕾中的DNA甲基化水平和siRNA丰度。

1. F.vesca WT和fvefdm1中所有基因和TE中CG、CHG和CHH甲基化的平均水平，包括转录起始位点（TSS）上游2kb和转录终止位点（TTS）下游2kb。
2. fvefdm1中CG、CHG和CHH中相对于WT的hyper-DMR和hypo-DMR数量。
3. WT和fvefdm1中hypo-DMR中的CG、CHG和CHH甲基化水平方框图。Center line, median; box limits, upper and lower quartiles; whiskers,1.5 X interquartile range; points, outliers.（A）和（C）设置三个生物学重复。
4. CG、CHG和CHH 中hypo-DMR的基因组分布。N（CG-hypo-DMR）=13563，n（CHG-hypo-DMR）=43141，n（CH-hypo-deMR）=74720。
5. CHH hypo-DMR在不同基因组区域分布。Promoter表示TSS上游2kb。Downstream表示TTS的下游2kb。
6. WT和fvefdm1中与基因组比对的小RNA的大小分布。数据表示为三个生物重复的平均值±SD。
7. 下调（downregulated）（n=23395）或随机（random）（n=233 95）siRNA簇与CHH-hypo-DMR重叠或不重叠的百分比。**P＜0.01，Fisher精确检验。

（6）FveFDM1突变导致的差异表达基因

图6：fvefdm1中DNA甲基化导致的DEG变化。

1. 与WT相比，fvefdm1的茎尖、花和果实中特异性和共有的差异表达基因（DEG）Venn图（倍数变化＞2，P＜0.01＝。
2. 与WT相比，fvefdm1花朵中CG、CHG和CHH环境下DEG的DNA甲基化变化热图（fvefdm1-WT）。
3. 在果实器官大小中具有潜在调控作用的候选DEG的log2转化倍数变化热图。
4. RT–qPCR检测三种共有上调基因在茎尖、花和果实中的表达水平。
5. 幼叶中三个共有上调基因的DNA甲基化水平的McrBC-qPCR分析。
6. RT–qPCR检测细胞周期基因在茎尖的表达水平。
7. 幼叶细胞周期基因DNA甲基化水平的McrBC-qPCR分析。
8. RT-qPCR检测7 DAP时果实中GA生物合成和分解代谢基因的表达水平。
9. 7 DAP时果实GA生物合成和分解代谢基因DNA甲基化水平的McrBC-qPCR分析。

在（E、G和I）中，对McrBC消化的基因组DNA进行qPCR，其中高qPCR信号表示较低的mC水平。以GAPDH（FvH4_4g24420）中没有DNA甲基化片段作为对照。（D-I）中的数据从三个生物学重复中获得的平均值±SD；**P＜0.01，学生t检验。

（7）FveFDM1介导的RdDM通路与GA和生长素互作

图7：RdDM与GA和生长素互作。

1. WT和fvefdm1幼叶中GA和生长素的含量。
2. GA 3处理2周后WT和fvefdm1叶片图像。比例尺:1 cm。
3. GA 3处理2周后WT和fvefdm1的叶柄长度和叶片面积。
4. GA 3 + NAA处理1个月后WT和fvefdm1未授粉果实的图像。比例尺：1cm。在(B)和(D)中，对单个图像进行数字提取以进行比较。
5. GA 3 + NAA处理1个月后WT和fvefdm1未授粉果实的宽度和长度。
6. GA 3处理24h后WT幼苗中FveFDM1及其他三个RdDM基因的表达水平。
7. GA 3处理24 h后WT幼苗细胞周期基因的表达水平。柱状图数据为三个生物学重复的平均值±SD;** P＜0.01，学生t检验。

关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）

全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。

易基因全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。

应用方向：

WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）

• 全基因组甲基化图谱课题
• 标志物筛选课题
• 小规模研究课题

技术优势：

• 应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
• 全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
• 单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整体解决方案，详询易基因：0755-28317900。

参考文献：

Zheng G, Hu S, Cheng S, Wang L, Kan L, Wang Z, Xu Q, Liu Z, Kang C. Factor of DNA methylation 1 affects woodland strawberry plant stature and organ size via DNA methylation. Plant Physiol. 2023 Jan 2;191(1):335-351. pii: 6749584.

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