文章名称：Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19
在由严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 (SARS-CoV-2) 感染引起的冠状病毒病 2019 (COVID-19) 中，疾病严重程度与宿主免疫反应之间的关系尚不完全清楚。在这里，我们对 5 名健康供体和 13 名 COVID-19 患者（包括中度、重度和恢复期病例）的外周血样本进行了单细胞 RNA 测序。通过确定免疫细胞的转录谱，结合组装的 TCR和 BCR，我们分析了免疫细胞的功能特性。 COVID-19 患者的大多数细胞类型显示出强烈的干扰素-α 反应和整体急性炎症反应。此外，高细胞毒性效应 T 细胞亚群的密集扩增，例如 CD4+ effector-GNLY（颗粒溶素）、CD8+ effector-GNLY 和 NKT CD160，与中度患者的康复有关。在重症患者中，免疫环境的特点是干扰素反应紊乱、严重的免疫衰竭、T 细胞受体库偏斜和广泛的 T 细胞扩增。这些发现说明了疾病进展过程中免疫反应的动态性质。
前言：
由 SARS-CoV-2 感染引起的 COVID-19 会导致一系列疾病，从轻度到重度疾病和死亡。虽然 SARS-CoV-2 与 SARS-CoV 类似，使用血管紧张素转换酶 2 (ACE2) 作为其进入靶细胞的受体 ，但两种病毒的病毒脱落模式不同。 SARS-CoV-2 病毒载量可在症状前阶段检测到，并在疾病发作后不久达到峰值，这明显早于 SARS-CoV。这些因素导致 SARS-CoV-2 的高传染性及其迅速传播，导致 COVID-19 的全球大流行。 SARS-CoV-2 感染和病毒感染介导的免疫反应都可以直接和/或间接损害 COVID-19 患者呼吸道中的细胞。大多数患者表现出轻度至中度症状，高达 15% 的患者发展为重症肺炎，大约 5% 的患者最终发展为急性呼吸窘迫综合征和/或多器官衰竭 。在患有合并症的老年人和免疫功能低下的人中观察到更高的死亡率。
由于目前尚无针对SARS-CoV-2的有效药物或疫苗，因此迫切需要更好地了解疾病期间的宿主免疫反应，以更好地设计预后和诊断标志物，并为患有严重疾病的患者设计适当的治疗干预措施。
病毒感染和抗病毒宿主免疫反应在体内相互作用并影响疾病严重程度以及临床结果，尤其是在急性病毒感染期间。因此，COVID-19的免疫病理学备受关注。中度疾病表现的 COVID-19 患者的免疫反应表明，急性 SARS-CoV-2 感染可引发强烈的细胞和体液免疫反应。然而，仍不清楚不受控制的先天性和受损的适应性免疫反应如何与肺组织损伤相关。具有严重疾病表现的 COVID-19 患者表现出明显的淋巴细胞减少和血清促炎细胞因子升高。我们最近报道了一例致命病例，观察到肺组织中明显的间质淋巴细胞浸润和外周血中T细胞的过度激活。最近，发现炎症性FCN1+巨噬细胞替代了来自严重SARS-CoV-2感染患者的支气管肺泡灌洗液中的FABP4+巨噬细胞，而在中度SARS-CoV-2感染的患者中观察到高度扩增和功能性的组织驻留克隆CD8 T细胞。这些观察结果乍看之下揭示新型冠状病毒肺炎进展的可能的免疫致病机制。然而，仍然缺乏对不同临床环境中的抗病毒或致病性免疫反应的整体表征。
在这里，我们实施了单细胞RNA测序 (scRNA-seq)，以获得中度至重度症状的COVID-19患者外周血单核细胞 (pbmc) 免疫反应的无偏和全面的可视化。我们的研究描述新型冠状病毒肺炎疾病进展过程中血液免疫细胞的高分辨率转录组图，这将有助于更好地了解疾病的保护性和致病性免疫反应。
结果：
结果1：外周免疫细胞的单细胞转录谱
为了表征 COVID-19 患者的免疫学特征，我们进行了基于液滴的 scRNA-seq（10X Genomics）来研究来自 13 名患者和 5 名健康供体（HD）作为对照的 PBMC 的转录组谱（图 1a）。 13 名 COVID-19 患者分为三种临床状况：中度（n = 7）、重度（n = 4）和恢复期（conv；n = 6，其中 4 例与中度病例配对）（图 1a， b）。还对每个受试者进行了单细胞 T 细胞受体 (TCR) 和 B 细胞受体 (BCR) 测序。在统一的单细胞分析流程（参见方法）之后，从所有样本的 PBMC 的 122,542 个细胞中获得了约 6 亿个独特的转录本。在这些细胞中，22,711 个细胞（18.5%）来自 HD 状态，37,901 个细胞（30.9%）来自于中度状态，24,640 个细胞（20.1%）来自于严重状态，37,290 个细胞（30.4%）来自恢复期状态。所有高质量细胞都被整合到一个数据集中，并在校正读取深度和线粒体读取计数后进行主成分分析（补充图 2a，b）。
a，由条件标识 (左) 和样本标识 (右) 着色的所有细胞的UMAP。
b，所有细胞中基因计数 (左)，UMIs (中) 和线粒体基因百分比 (右) 的UMAP。
c，血浆干扰素和细胞因子水平跨越四种条件: HD (n = 10)，中度 (n = 7)，重度 (n = 4) 和Conv (n = 6) 样本。
使用基于图形的统一流形近似和投影聚类（UMAP），我们根据典型基因标记的表达捕获了 14 种主要细胞类型或亚型的转录组（图 1c-e 和补充图 2a，b）。这些细胞包括幼稚状态T（幼稚T）细胞（CD3+CCR7+）、活化状态T（活化T）细胞（CD3+PRF1+）、黏膜相关不变T（MAIT）细胞（SLC4A10+TRAV1-2+） , γδ T 细胞 (TRGV9+TRDV2+), 增殖性 T (pro T) 细胞 (CD3+MKI67+), 自然杀伤 (NK) 细胞 (KLRF1+), B 细胞 (MS4A1+), 浆 B 细胞 (MZB1+), CD14+ 单核细胞 (CD14+单核细胞；LYZ+CD14+)、CD16+ 单核细胞 (CD16+ mono; LYZ+FCGR3A+)、单核细胞衍生的树突状细胞 (mono DCs; CD1C+)、浆细胞样树突状细胞 (pDCs; LILRA4+)、血小板 (PPBP+) 和造血干细胞 (HSCs; CYTL1+GATA2+)。因此，我们清楚地定义了外周血中细胞亚群的组成。
a，显示整体研究设计的示意图。 scRNA-seq 在四个条件下应用于 PBMC，输出数据用于 TCR 和 BCR 分析和表达分析。
b，13 名感染 SARS-CoV-2 并参加我们研究的患者的病程时间表。 RT-qPCR 表示对 SARS-CoV-2 核酸进行 PCR 检测。 RT-qPCR 阳性表示鼻咽或痰液样本对 SARS-CoV-2 核酸呈阳性。左侧的颜色条表示与 a 中颜色相同的条件。
c，确定的细胞群。来自 HD (n = 5)、中度 (n = 7)、严重 (n = 4) 和 conv (n = 6) 样本的 122,542 个单细胞的 UMAP 投影，显示形成了 14 个具有相应标签的簇。每个点对应一个单元格，根据单元格类型着色。
d，典型细胞标记用于按细胞身份标记簇，如 UMAP 图所示。数据根据表达水平着色，图例以对数刻度标记。
e，小提琴图显示了 14 个集群中选定的典型细胞标记的表达分布。行代表选定的标记基因，列代表与 c 中颜色相同的簇。
结果2：不同疾病条件下细胞组成的差异
为了揭示三种条件下（中度、重度和转化）细胞组成的差异，并与 HD 中的比较，我们根据 scRNA-seq 数据计算了每个个体 PBMC 中 14 种主要细胞类型的相对百分比（图 2a-d）。活化 T 细胞簇的相对百分比在中度患者中达到峰值，并且即使在恢复期也没有恢复到正常水平。值得注意的是，幼稚 T 细胞、MAIT 细胞和mono DCs 的相对丰度随着疾病严重程度而降低，这些群体后来在 conv 患者中恢复（图 2d）。相反，pro T 细胞、浆 B 细胞、CD14+ 单核细胞和血小板的相对百分比随着疾病严重程度而增加，后来在 conv 患者中下降（图 2d）。严重疾病患者中 CD14+ 单核细胞的大量增加与最近的一项研究一致，该研究表明由致病性 T 细胞诱导的炎性单核细胞会引发 COVID-19 中的炎性风暴。
接下来，为了研究 SARS-CoV-2 感染期间的抗病毒和病原免疫反应，我们评估了在四种条件下的主要细胞类型。我们发现，在 COVID-19 患者的 PBMC 的所有主要细胞类型中，对 IFN-α 的反应均显着上调，并且在重症患者的几乎所有主要细胞类型中均显示出最高值，但浆 B 细胞除外，其中中度患者的 IFN-α 反应最大（图 2e）。此外，除前T细胞外，急性炎症反应在所选细胞类型的条件下表现出一致和显著的差异。几种细胞类型显示出与疾病严重程度大致对应的急性炎症反应趋势，包括活化的 T 细胞、γδ T 细胞、NK 细胞和 CD16+ 单核细胞（图 2e）。此外，I 型 IFN、IFN-γ 和其他炎性细胞因子的血浆水平在重症患者中表现出最高水平（补充图 2c）。这些结果表明 COVID-19 患者存在强烈的整体促炎反应（图 2e）。
a，HD、中度、重度和转换条件的 UMAP 投影。每个点对应一个单元格，根据单元格类型着色。
b，源自 HD (n = 5)、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 样本的每种细胞类型的平均比例。
c，顶部点图显示每个样本的 PBMC 中淋巴细胞和单核细胞的绝对计数总和。底部条形图显示了单个样本水平的细胞组成。
d，每个集群的条件偏好。 y 轴，四个条件下样本的平均百分比。条件以不同的颜色显示。每个条形图代表一个细胞簇。
e，来自 HD (n = 5)、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 样本的集群中两个 GO 生物过程项的表达水平的箱线图。条件以不同的颜色显示。
结果3：在先天免疫细胞中观察到强烈的干扰素反应
为了进一步研究 SARS-CoV-2 感染后先天免疫细胞的转录组变化（图 3a、b），我们比较了 CD14+ 和 CD16+ 单核细胞中中度或重度疾病与 HD 疾病的表达模式。我们发现显着差异表达的基因（DEGs）参与了 COVID-19 患者的 IFN 反应、骨髓白细胞活化、细胞因子产生和NF-κB 信号通路（图 3c，d）。此外，来自严重疾病的单核细胞中更多的 DEG 富含分子代谢和分解代谢过程，以及细胞因子分泌（补充图 3a）。对于 NK 细胞，与单核细胞类似，与 IFN 反应、细胞因子产生、NF-κB 信号通路和白细胞细胞毒性相关的 DEG 在 COVID-19 患者中显着富集（图 3e、f），表明先天免疫细胞的反应一致SARS-CoV-2 感染。此外，与中度患者相比，重症 NK 细胞的 DEG，如 ITGB2、CCL5 和 CXCR2，与迁移相关过程更密切相关（补充图 3b，c）。
与 DEG 富集结果一致，我们发现单核细胞和 NK 细胞在 SARS-CoV-2 感染后均表现出显着上调的 IFN 和急性炎症反应，尤其是在重症患者中（图 2e）。与 HD 条件相比，单核细胞和 NK 细胞中的细胞凋亡和迁移水平也上调（图 3g）。与单核细胞和 NK 细胞中相当的细胞凋亡水平不同，重症患者的先天免疫细胞比中度患者更容易迁移（图 3g 和补充图 3c）。这些结果表明，COVID-19 患者的大多数先天免疫细胞类型显示出强烈的 IFN 反应。
a，单核细胞 (39,276) 和 NK 细胞 (7,479) 的 UMAP 投影。每个点对应一个单元格，根据单元格类型着色。
b，HD、中度、重度和转换条件的 UMAP 投影。
c，散点图显示中度（n = 7）或重度患者（n = 4）与 HD（n = 5）的单核细胞中的 DEG。每个红点表示一个单独的基因。
d，c中红色DEG的基因富集分析。 GO 术语标有名称和 ID，并按 -log10 (P) 值排序。颜色越深表示 P 值越小。显示了前 20 个丰富的 GO 术语。有趣的术语用红色标记。
e，类似于 c 的散点图，但适用于 NK 细胞。
f，与 d 类似的基因富集分析，但针对 NK 细胞。
g，来自 HD (n = 5)、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 样本的集群中两个 GO 生物过程术语在单核细胞和 NK 细胞中表达水平的箱线图.条件以不同的颜色显示。
a，与健康供体相比，中度患者而不是重度患者的单核细胞中DEGs的基因富集分析 (顶部)，与健康供体相比，重度患者而不是中度患者的基因富集分析 (底部)。GO术语标有名称和ID，并按-log10 (P) 值排序。颜色较深表示p值较小。
b，类似 (a) 图，但对于NK细胞。
c，点图显示了在四个条件下与NK细胞 (左) 和单核细胞 (右) 迁移过程相关的基因表达。
结果4：COVID-19患者T细胞亚群的特征
为了表征四种条件下个体中T 细胞亚群的变化，我们对来自 PBMC 的 T 细胞进行亚聚类，并根据典型 T 细胞标志物的表达和分布获得 12 个亚群（图 4a，b）：CD4+ T 细胞的 6 种亚型（ CD3E+CD4+)、3 个 CD8+ T 细胞亚型 (CD3E+CD8A+) 和 3 个 NKT 细胞亚型 (CD3E+CD4–CD8A–TYROBP+)。
CD4+ T细胞簇的六种亚型中，除了幼稚CD4+（CD4+幼稚）T细胞（CCR7+SELL+）、记忆CD4+（CD4+记忆）T细胞（S100A4+GPR183+）、效应记忆CD4+（CD4+效应记忆）T细胞 (S100A4+GPR183+GZMA+) 和调节性 T (Treg) 细胞 (FOXP3+IL2RA+) 亚型，我们定义了两种效应 CD4+ T 亚型，CD4+ 效应-GZMK 和 CD4+ 效应-GNLY。 CD4+ 效应子-GNLY 簇的特征是与细胞毒性相关的基因高表达，包括 NKG7、GZMA、GZMB、GZMH 和 GNLY，而 CD4+ 效应子-GZMK 簇显示 GZMK 基因的相对高表达，但其他细胞毒性基因的低表达基因（图4b和补充图4a，b）。此外，CD4+ 效应子-GNLY 细胞显示出 TBX21 的高表达，这意味着它们是 1 型辅助 T（TH 1）样细胞（补充图 4c）。相反，CD4+效应-GZMK和CD4+效应记忆具有2型辅助T（TH 2）细胞样特征，GATA3高表达（补充图4c）。CD8+T细胞簇的三个亚型包括一个初始CD8+（CD8+初始）T细胞亚群（CCR7+SELL+）和两个效应器CD8+T细胞亚组（CD8+效应器GZMK和CD8+效果器GNLY），它们都具有GZMA和NKG7的高表达水平。详细地说，CD8+ 效应子-GZMK 独特地表达 GZMK，而 CD8+ 效应子-GNLY 显示出相对高的 GZMB/H 和 GNLY 表达水平（图 4b 和补充图 4a、b）。 NKT细胞簇的三个亚群被定义为幼稚NKT（NKT幼稚）细胞（CCR7 + SELL +），CD56 + NKT（NKT CD56）细胞和CD160 + NKT（NKT CD160）细胞（图4a，b）。
为了深入了解 T 细胞亚群的特征，我们评估了每个集群在四种条件下的分布（图 4c 和补充图 4d，e）。值得注意的是，与 HD 相比，COVID-19 患者的幼稚状态 T 细胞亚群的比例，包括 CD4+ 幼稚、CD4+ 记忆、CD4+ 效应记忆、Treg、CD8+ 幼稚和 NKT 幼稚亚群的比例降低（图 4c 和补充图. 4d)。即使在 conv 条件下，CD4+ naive、CD8+ naive 和 Treg 簇的比例也没有恢复到 HD 的水平（图 4c 和补充图 4d）。相反，在新型冠状病毒肺炎患者中，包括CD4效应子-GNLY、CD8效应子-GNLY、NKT CD56和NKT CD160亚群在内的活性状态T细胞亚群的比例增加，即使在conv患者中，这些细胞毒性亚群的比例也很高 (图4c)。特别值得注意的是，HDs中几乎不存在CD4效应子亚群，但在中度，重度和conv患者中高度富集。此外，与中度患者相比，重症患者的NKT CD160子集的丰度显着降低。
然后我们评估了四种条件下不同效应状态 T 细胞亚群的细胞毒性和耗竭评分（图 4d 和补充图 4f）。 CD4+ 效应子-GNLY、CD8+ 效应子-GNLY、NKT CD56 和 NKT CD160 亚群的细胞毒性评分高于其他亚群。在这些高细胞毒性簇中，HDs 都具有最低的细胞毒性评分，而中等条件显示出最高的细胞毒性状态，CD4+ 效应子-GNLY 子集除外（图 4d、e 和补充图 4f）。同时，CD4+ 效应子-GZMK、CD8+ 效应子-GZMK 和 NKT CD160 簇显示出比其他子集更高的衰竭分数。在这些高度耗竭的亚群中，HD 的耗竭评分最低，而重症患者表现出最耗竭的状态（图 4d、e 和补充图 4f），这与之前检查重症患者的 CD8+ T 细胞和发现高度疲惫的状态和功能障碍。
为了进一步研究 SARS-CoV-2 感染后 T 细胞的差异转录组变化，我们比较了中度或重度和 HD 条件下效应 T 细胞（不包括 CD4+ 初始、CD4+ 记忆、CD8+ 初始和 NKT 初始簇）的表达谱。我们观察到在 COVID-19 患者中上调的 DEG 参与了包括 IFN 反应、细胞因子产生、细胞杀伤、白细胞-细胞粘附和细胞骨架组织在内的过程（图 4f、g 和补充图 4i）。此外，使用细胞凋亡和迁移评分系统，我们观察到重症患者中的 T 细胞可能经历了迁移和细胞凋亡（图 4h，i 和补充图 4g，h）。重症患者 PBMC 中细胞死亡和迁移途径的显着激活表明细胞死亡和淋巴细胞迁移可能与淋巴细胞减少有关，这是在重症 COVID-19 患者中观察到的常见现象（参考文献 18,19,24）。
a，55,655 个 T 细胞的 UMAP 投影。每个点对应一个单元格，根据单元格类型着色。
b，小提琴图显示了 12 个 T 细胞亚群中典型细胞标记的表达分布。 c，各亚群在4个组别的占比情况。
d，不同集群和条件下的细胞毒性和耗竭评分的箱线图。沿 x 轴的正方形表示对应于 a 中的子集的子集。
e，点图显示了四种条件下 NKT CD160 细胞中明确的细胞毒性和衰竭相关基因的表达水平。
f，中度（n = 7）或重度（n = 4）患者与 HD（n = 5）相比的 DEG。每个红点表示单个基因，示例基因标有基因名称。
g，DEGs 的基因富集分析用红色着色，如 f 所示。GO 术语用红色标记。
h，在 HD (n = 5)、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 样本中的两个 GO 生物过程项的每个集群的中值细胞分数的箱形图。
i，来自 HD (n = 5)、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 样本的集群中两个 GO 生物过程术语的表达水平。
a，典型细胞标记被用于通过细胞同一性标记簇，如UMAP图所示。群集根据表达级别进行着色，并且图例以对数刻度进行标记。
b，热图显示了每个细胞簇中所选T细胞功能相关基因的z分数标准化平均表达。
c，小提琴图显示了三个效应CD4 T亚群细胞中选定的典型T辅助标记的表达分布。
d，来自HD (n = 5)，中度 (n = 7)，重度 (n = 4) 和Conv (n = 6) 样本的每种T细胞亚型的平均比例。
e，上图显示了PBMC样品中淋巴细胞的绝对计数。底部条形图显示了单样本水平的T细胞组成。
f，点图显示了在图4d中细胞中某些明确定义的幼稚，细胞毒性和耗尽的基因在四个条件下的表达。
g，分别与健康供体比较，中度患者 (上) 和重度患者 (下) T细胞中DEGs的基因富集分析。
h，点图显示了与干扰素 α 和 β 反应，凋亡和迁移过程相关的某些基因在四个条件下的表达。
i，跨HD (n = 5)，中度 (n = 7)，重度 (n = 4) 和Conv (n = 6) 样本的每个干扰素 α 和 β 反应相关基因簇的中位细胞得分的盒形图。条件以不同的颜色显示。
结果5：T 细胞中的克隆扩增和 COVID-19 患者中 V(D)J 基因的首选使用
接下来，为了深入了解个体 T 细胞之间的克隆关系和 V(D)J 基因在四种条件下的使用，我们从 TCR 测序中重建了 TCR 序列。简而言之，除了三个 NKT 亚群之外，所有亚群中有超过 70% 的细胞具有匹配的 TCR 信息（图 5a，b）。首先，与HDs相比，新型冠状病毒肺炎患者和恢复期患者的克隆扩增明显 (图5c-e)。中度和conv条件下的克隆扩张程度高于重度条件下的克隆扩张程度。同时，在严重状况下不存在大的克隆扩增 (克隆大小>100) (图5e)，表明严重患者可能缺乏效应T细胞的有效克隆扩增。我们观察到T细胞亚群之间不同程度的克隆扩增 (图5c，d)。效应T细胞亚群CD4效应-GNLY，CD8效应-GZMK和CD8效应-GNLY显示高比例的克隆细胞 (图5a，d和补充图5a)，并包含高比例的簇间克隆细胞 (图5f)，提示效应T细胞经历了动态状态转换 (图5a，f)。
为了研究新型冠状病毒肺炎和HDs患者中TCR的动态和基因偏好，我们比较了四种情况下V(D)J基因的使用情况 (图5g-i和补充图5b)。前10个互补决定区3 (CDR3) 序列在四个条件下是不同的 (图5h)。中度和conv条件共享一些CDR3序列，因为来自这些条件的四个样本成对。与其他三个条件相比，HD条件下的前10个CDR3序列的使用百分比更低且更平衡。值得注意的是，我们在新型冠状病毒肺炎患者中发现了V(D)J基因的不同用法，其多样性降低，这在TRA基因中更为明显 (图5i)。与中度和conv患者相比，我们还发现了严重患者中TRAJ39和TRAJ43的过度表现 (图5g)。在重症患者中优选的TRBJ基因是TRBJ1-1的，而在中度和conv患者中优选TRBJ2-1 (图5i)。V(D)J基因的选择性使用表明不同的免疫显性表位可能驱动T细胞反应的分子组成，并且可能与SARS-CoV2特异性感染有关。
a，源自 PBMC 的 T 细胞的 UMAP。簇由标记有推断细胞类型（左上）、TCR 检测（右上）、属于相同簇（左下）和不同簇（右下）的选定 TCR 克隆的颜色表示。
b，条形图显示每个 T 细胞簇中 TCR 检测的百分比。
c，T细胞克隆数与每个克隆型细胞数之间的关联。虚线将非克隆细胞和克隆细胞分开。黄土拟合被标记为实线，显示两个轴之间的负相关。
d，每个簇中T细胞克隆状态的分布。
e，四种条件下 T 细胞的克隆状态百分比（左）和不同水平的克隆 T 细胞百分比（右）。
f，每个子集中克隆细胞的比例（x 轴）和具有跨集群共享的 TCR 的细胞百分比（y 轴）之间的比较。
g，在四种条件下使用一些 TRAV（左上）、TRAJ（左下）、TRBV（右上）和 TRBJ（右下）基因。
h，显示了前十个 CDR3 用法。每个条都按条件标识着色。共享的 CDR3 序列以红色字体显示。
i，四个条件下的 TRA/B 重排差异。颜色表示特定 V-J 基因对的使用百分比。
a，饼图显示了在HD，中度，重度和Conv条件下不同簇中克隆扩增细胞的分布。
b，在HD，中度，重度和Conv条件下使用TRAV，TRAJ，TRBV和TRBJ基因。条件以不同的颜色显示。
结果6：COVID-19患者B细胞亚群的特征
为了追踪不同B亚型的动态变化，我们根据典型B细胞标记物的表达和分布将B细胞亚群分成六个亚群（图6a、B和补充图6a）。我们确定了一个原始B亚群（MS4A1+IGHD+）、一个记忆B亚群（MS4A1+CD27+），一个中间过渡记忆B亚群（“中间记忆B”；IGHD+CD27+）和一个生发中心B亚群（“MS4A1+NEIL1+）和两个血浆亚群，血浆B（MZB1+CD38+）和分裂血浆B（MZB1+CD38+MKI67+）。
值得注意的是，与HDs患者相比，新冠肺炎患者的活性状态B亚群（包括生发中心B、血浆B和分裂血浆B亚群）的比例增加。相反，与HDs患者相比，新冠肺炎患者的记忆B细胞比例下降（图6c-e）。
为了进一步研究 SARS-CoV-2 感染后 B 细胞的差异转录组变化，我们比较了中度或重度疾病 B/浆细胞与 HD 疾病的表达谱。在 COVID-19 患者中最显着富集的 DEG 参与了与 IFN 反应相关的基因（图 6f、g 和补充图 6c）。此外，重症患者的 DEG 与蛋白质合成、成熟和运输相关的生物过程相关（补充图 6b）。这些结果揭示了 COVID-19 患者 B 细胞亚群的转录组学特征。
a，11,377 个 B 细胞的 UMAP 投影。每个点对应一个单元格，根据单元格类型着色。
b，典型细胞标记用于按细胞身份标记簇，如 UMAP 图所示。数据根据表达水平着色，图例以对数刻度标记。
c，源自 HD (n = 5)、中度 (n = 7)、重度 (n = 4) 和 conv (n = 6) 样本的每种 B 细胞亚型的平均比例。
d，条形图显示单个样本水平的 B 细胞组成。
e，每个集群的条件偏好。 y 轴显示四种条件下的平均样本百分比。条件以不同的颜色显示。每个条形图代表一个细胞簇。
f，散点图显示中度（n = 7）或重度（n = 4）患者与 HD（n = 5）患者的 DEG。每个红点表示一个单独的基因，示例基因标有基因名称。
g，DEGs 的基因富集分析用红色着色，如 f 所示。 GO 术语标有名称和 ID，并按 -log10 (P) 值排序。颜色越深表示 P 值越小。显示了前 20 个丰富的 GO 术语。值得注意的术语用红色标记。
a，小提琴图显示了六个b细胞簇中选定的典型细胞标记的表达分布。列对应于所选择的标记，并且行对应于图6a中具有相同颜色的簇。
b，分别与HDs比较，中度患者 (上) 和重度患者 (下) b细胞中DEGs的基因富集分析。GO术语标有名称和ID，并按-log10 (P) 值排序。c，横穿HD (n = 5)，中度 (n = 7)，重度 (n = 4) 和Conv (n = 6) 样本的每个干扰素 α 和 β 反应相关基因簇的中位细胞得分的盒图。条件以不同的颜色显示。
d，b细胞克隆数与每个克隆型细胞数之间的关联。虚线将非克隆细胞和克隆细胞分开。黄土拟合被标记为实线，显示两个轴之间的负相关。
e，IGHV/J，IGKV/J和IGLV/J基因在四个条件下的使用。条件以不同的颜色显示。
结果7：重症患者的 B 细胞扩增和 V(D)J 基因的特异性重排
我们还从 BCR 测序重建了 BCR 序列（补充表 3）并分析了 BCR 克隆扩增的状态。简而言之，每个簇中 BCR 的检测百分比超过 75%（图 7a，b）。我们发现来自重症患者的 B 细胞比其他三种情况表现出明显的克隆扩增（图 7c 和补充图 6d），表明 B 细胞活性和体液免疫反应在重症患者中被强烈激活，这让人想起之前的观察结果：较高的抗体滴度与较差的临床结果相关。这引起了人们的关注，即针对病原体的抗体可以促进疾病病理，导致类似于在 SARS 中观察到的抗体依赖性增强。
接下来，我们分别评估了中度、重度和 conv 条件下每位患者的 IgA、IgD、IgG 和 IgM（未检测到 IgE）的分布。在大多数患者中，IgM 是主要的免疫球蛋白（图 7d，e）。与 HD 相比，COVID-19 患者的 IgG 丰度增加，而 IgM 减少。在恢复期患者中，IgG 和 IgM 水平恢复到与 HD 相似的水平。
为了研究 BCR 的偏向 V(D)J 重排，我们比较了四种条件下 V(D)J 基因的使用（图 7f，g 和补充图 6e）。与其他三种情况相比，我们发现在严重情况下更具体的 V(D)J 使用，表明 B 细胞可能在严重患者中经历了独特和特异性的 V(D)J 重排（图 7g）。我们还发现 IGHJ4 在所有 HD 和患者中的综合使用（图 7f），但与其他三种情况的患者相比，重症患者的 IGHJ4 的配对 IGHV 基因不同（图 7g）。我们观察到重症患者中 IGHV3-7 的过度表达（图 7f）。此外，严重患者的前两对 V-J 频率是 IGHV3-7/IGHJ4 和 IGKV3-15/IGKJ3（图 7g）。综上所述，重症患者 B 细胞克隆性的增加和 IGHV 和 IGKJ 基因的倾斜使用表明 SARS-CoV-2 感染与宿主 B 细胞中的 V(D)J 重排有关。值得注意的是，在重症患者中选择性使用优势 IGV 基因，尤其是 IGHV3-7 和 IGKV3-15，可能有助于疫苗的设计。
a，源自 PBMC 的 B 细胞的 UMAP。簇用颜色表示并用推断的细胞类型标记（左）。 B 细胞的 UMAP 也根据 BCR 检测着色（右）。 b，条形图显示每个 B 细胞簇中 BCR 检测的百分比。
c，条形图显示每个簇中 B 细胞的克隆状态分布。
d，条形图显示每种条件下 IGHA、IGHD、IGHG 和 IGHM 的百分比，
e，条形图显示了单个样本水平上 IGHA、IGHD、IGHG 和 IGHM 的百分比。
f，一些 IGHV（左上）、IGHJ（右上）、IGKV（左中）、IGKJ（右中）、IGLV（左下）和 IGLJ（右下）基因在 HD、中度、重度和 conv 中的使用条件。条件以不同的颜色显示。
g，热图显示了 HD、中度、重度和 conv 条件下的 IGH/K/L 重排差异。颜色表示特定 V-J 基因对的使用百分比。
Discussion
COVID-19 通常被认为是一种急性自限性病毒性疾病，尽管尚不清楚 SARS-CoV-2 感染是否会导致无症状携带者的慢性疾病。宿主对急性 SARS-CoV-2 感染的免疫反应不仅起到抗病毒作用，还会导致器官和组织同时发生致病性损伤，尤其是 COVID-19 患者的肺部，这决定了疾病的严重程度、进展和结果.研究报告了先天性和适应性免疫反应的特征，这有助于我们了解 SARS-CoV-2 感染的潜在发病机制。然而，很难获得 SARS-CoV-2 感染后细胞和分子免疫反应的综合情景。为了解决这个问题，我们以单细胞分辨率分析了新冠肺炎患者的免疫反应情况，这说明了疾病进展过程中细胞反应的动态性质，并揭示了中重度患者抗病毒免疫和发病机制的关键因素。
我们的研究为新型冠状病毒肺炎患者的免疫标志提供了公正的可视化。首先新型冠状病毒肺炎患者表现出一致且强烈的IFN-α 反应，整体急性炎症反应和增强的迁移能力，在pbmc中大多数主要细胞类型的严重疾病患者中达到顶峰。其次，新型冠状病毒肺炎患者中观察到广泛的免疫激活，其证据是活化的T，pro T和血浆b细胞的比例增加，而幼稚的T和mono DC的比例减少。第三，活跃状态T细胞簇的比例在COVID-19患者中显著更高，效应T细胞亚群优先富集，如中等患者中的CD4效应-GNLY、CD8效应-GNLY和NKT CD160细胞，重症患者中的NKT CD56亚群。T细胞在中度患者中显示出更高的细胞毒性和更强大的扩增，而在重度患者中观察到更高的衰竭水平和更低的特异性克隆扩增。第四，b细胞在重症患者中经历了独特且特定的V(D)J重排，这表现为b细胞克隆性的增加以及IGHV和IGKJ基因的使用偏斜。最后，尽管大多数临床参数在康复初期恢复到正常范围，但免疫系统的状态并未完全恢复，例如幼稚T和Treg亚群的比率。需要进行长期随访研究，以调查COVID-19患者实现完全免疫恢复需要多长时间。
中度患者的有效抗病毒免疫反应的特征是先天免疫信号的中度和广泛激活以及高度细胞毒性效应T细胞亚群的扩增。扩展的效应T簇，包括CD4效应子-GNLY，CD8效应子-GNLY，NKT CD56和NKT CD160，具有NKG7，GZMA，GZMB，GZMH和GNLY的高表达特征，并可能通过其直接细胞毒性促进SARS-CoV-2感染的快速解决。CD4效应子-GNLY簇类似于经典的CD4细胞毒性T细胞。CD4细胞毒性T细胞具有主要的组织相容性复合体II类限制的细胞毒性活性，在病毒感染，自身免疫病和恶性肿瘤中起重要作用。此外，识别可能预测或预防严重疾病进展的免疫因素非常有意义。值得注意的是，在重度患者中，NKT CD160簇在中度患者中的扩展几乎没有。NKT CD160簇是指先前描述的 γ δ NKT或vδ1t细胞亚群，其显示出与传统NK细胞的表型和功能相似性。此外，FCGR3A也是NKT CD160簇中富集的基因之一，表明它可能介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。此外，vδ1t细胞与对病毒感染的免疫反应有关，特别是对巨细胞病毒，Epstein-Barr病毒和vδ1t细胞也可以识别广泛的癌细胞。新型冠状病毒肺炎一样，NKT CD160细胞的优先扩增可能通过直接的细胞毒性以及介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用来促进疾病的快速控制。型冠状病毒肺炎中NKT CD160细胞扩增和功能的潜在机制值得进一步研究。研究vδ1t细胞是否可用于过继细胞疗法以抑制明显的COVID-19相关组织和器官损伤将是有价值的。
严重患者疾病恶化的免疫病理特征是IFN反应紊乱，严重的免疫衰竭，TCR谱倾斜和T细胞广泛扩增。值得注意的是，先前传染性非典型肺炎-CoV的研究表明，该病毒可以利用多种机制来拮抗宿主细胞12中的IFN反应。根据体外细胞感染的结果，SARS-CoV-2被认为是I型 IFNs的弱诱导剂。然而，我们观察到，与中度患者相比，重症患者PBMC中几乎所有类型的细胞都有强烈的IFN-α反应。考虑到病毒负担在发病后不久即达到峰值，然后逐渐降低，似乎重症患者的系统性IFN-α 信号激活可能是由除单独病毒以外的其他因素引起的。IFN通路的过度激活可能导致严重新型冠状病毒肺炎患者的免疫功能障碍和免疫损伤。特别是，IFN-α2b雾化在SARS-CoV-2感染中得到广泛应用，它是从治疗中东呼吸综合征和SARS42发展而来的。使用IFN进行治疗可能需要仔细的重新考虑和复查，尤其是在严重新型冠状病毒肺炎病例中。
这项研究有几个局限性。例如，当我们进行这项研究时，由于生物安全原因，在COVID-19爆发期间很难在支气管肺泡灌洗液中获得免疫细胞。此外，样本量相对较小。因此，未来对更多COVID-19患者的纵向样本的研究可能有助于确定不同细胞类型的免疫特性与疾病结局之间的因果关系。
综上所述，我们研究中的这种整合的多细胞描述为将来表征对SARS-CoV-2感染的复杂的动态免疫反应奠定了基础。转录组数据，加上详细的基于TCR和BCR的谱系信息，可以作为更深入了解新型冠状病毒肺炎患者外周血淋巴细胞的丰富资源，并为合理设计疗法和开发SARS-CoV-2特异性疫苗铺平道路。