今天分享的是2020年5月份发表在Molecular Oncology的一篇文章，标题是Classification of diffuse lower‐grade glioma based on immunological profiling，影响因子5.962。
研究背景
弥散性低级神经胶质瘤（LGG）是由胶质细胞或前体细胞引起的浸润性脑肿瘤，与胶质母细胞瘤（GBM，IV级）相比，病程更柔和，患者生存范围广泛（从1到15年），并且按肿瘤类型分层时差异很大。研究表明不同的免疫疗法可以成功治疗许多恶性肿瘤，然而并非所有患者都能从免疫治疗中受益。对于成功的免疫治疗方法，需要更好地了解肿瘤特异性免疫微环境。越来越多的研究表明，TME在神经胶质瘤的不同亚型中仍然高度不同。目前弥漫性LGG的免疫微环境尚未完全表征，加深对LGG免疫微环境的了解，将会为个性化免疫治疗提供了有价值的信息。
数据下载
1) 从TCGA数据库获取弥散性低级神经胶质瘤样本(n=402)的RNA-seq数据，体细胞突变及拷贝数数据、临床信息数据——训练集
2) 从CGGA数据库获取弥散性低级神经胶质瘤样本(n=171)的RNA-seq数据，临床信息和生存数据——验证集(cohort 1)
3) 从CGGA数据库获取弥散性低级神经胶质瘤样本(n=274)的RNA-seq数据，临床信息和生存数据——验证集(cohort 2)
4) 从CGGA数据库获取弥散性低级神经胶质瘤样本(n=171)的微阵列数据，临床信息和生存数据——验证集(cohort 3)
结果展示
1. 弥散性低级神经胶质瘤免疫亚型的鉴定和验证
作者根据先前报道的782个免疫相关基因，采用共识聚类的方法对来自TCGA 数据库的402个弥散性LGG样本的数据集进行聚类(50次迭代，80%重采样率)。累积分布函数和共识热图用于评估最佳k=3(三个子类被定义为Im1、Im2、Im3)，即弥漫性低级神经胶质瘤被分为Im1、Im2、Im3三个免疫亚型。
为了验证CGGA队列中的免疫亚型，作者首先鉴定了训练集和验证集中共有的免疫相关基因(751个基因)。在训练集中，使用微阵列预测分析（PAM）对基因进行训练，以构建基于基因的分类器。在验证集中，使用基于验证集中构建的PAM分类器对每个验证队列样本归属免疫亚型分类，并注释分子和临床信息(图1B-D)；
主成分分析(PCA)显示不同免疫亚型之间的基因表达模式存在明显差异(图2A)，
三种免疫亚型在训练集和验证集中显示出相似的预后和病理特征(图2B,C)。作者采用IGP方法评估了训练集和验证集之间获得性免疫亚型的相似性和可重复性。
2.免疫亚型的细胞和分子特征
为了揭示这三种亚型之间的免疫异质性，作者采用了几种与免疫相关的工具进行分析。首先根据ESTIMATE方法计算了基质评分、免疫评分和肿瘤纯度(图3A)，发现Im2亚型具有较高的免疫评分、基质评分和较低的肿瘤纯度；然后进行CIBERSORT分析计算淋巴细胞和M2巨噬细胞比例，发现Im1 的淋巴细胞百分比增加，而Im2和Im3则显示出更高水平的M2巨噬细胞(图3B)；最后通过ssGSEA分析三种免疫亚型中免疫细胞类型和功能的富集水平(图3C)。此外作者还分析了HLA和检查点基因在三种亚型之间表达水平(结果放在补充材料中)。
3.浸润性免疫细胞与预后的相关性
接下来作者通过Cox回归对免疫评分和患者OS的相关性进行分析，发现当按免疫亚型分层时，在Im2中观察到存活率提高与溶细胞活性相关，并且中性粒细胞或Treg得分高的Im1患者往往有更好的预后(图4A,B)。此外作者还评估了主要免疫检查点的预后价值，发现PDCD1，HAVCR2和IDO1的高表达意味着预后更差(结果放在补充材料中)。这些结果表明浸润的免疫细胞可能会影响患者的预后，并为弥漫性LGG的免疫治疗提供了有价值的靶标。
4.免疫亚型的基因组变异
作者进一步探讨了这三种免疫亚型之间基因组改变的差异。发新Im2亚型具有更明显的非整倍性变异，同源重组缺陷以及较高的拷贝数负荷和肿瘤突变负荷（图5A）。将基因组突变与免疫亚型进行相关性分析，发现Im1富含IDH1，1P/19Q 共缺失，CIC，FUBP1和NOTCH1突变；Im2富含驱动基因的突变，如PTEN，EGFR和NF1；Im3富含IDH1，ATRX和TP53突变（图5B）。GISTIC2.0分析免疫亚型中不同的拷贝数改变(CANs)，发现Im2显示出更频繁的缺失或扩增区域，例如CDKN2A / CDKN2B，EGFR1，CDK4，KIT和PDGFRA等。这些发现表明，具有高免疫浸润的肿瘤可能具有更高水平的基因组改变。
5.降维分析确定了Im2中的两个不同的子组
为了定义弥散性LGG的免疫状况，作者通过降维分析发现，Im2可以进一步分为两个亚组Im2A和Im2B(图6A,B)，其中Im2A具有更好的结局（图6C）。ssGSVA分析发现Im2A与较高水平的免疫细胞和功能相关（图6D）。CIBERSORT分析发现Im2A的M2巨噬细胞百分比增加(图6E)。这些数据表明免疫亚型内存在明显的簇内异质性。
3.6使用Cox比例风险模型开发和验证免疫相关特征
考虑到患者预后与免疫浸润之间的紧密联系，作者使用Cox比例风险模型开发了与免疫相关的特征以进行预后预测。SAM分析发现Im2和Im1/Im3亚型之间有421个差异表达的免疫基因，单变量Cox回归分析显示，差异基因中有359个与患者的OS显著相关(图7A)。然后，作者应用Cox比例风险模型选择了具有最佳预后价值的基因（图7B）。鉴定出8个基因的标记（图7C），并根据其表达水平和回归系数计算出风险评分。发现高风险评分集中于Im2，经典型和间充质型胶质瘤，III级或IDH野生型肿瘤中(图7D)。Kaplan–Meier分析显示，高风险评分意味患者预后较差（图7E，F）。作者通过计算风险评分，年龄和等级的AUC（曲线下面积）进一步评估了预测准确性，发现风险评分的AUC（85.5％）远高于年龄（77.8％）和等级（68.5％）（图7G）。这些数据证明了免疫标志物在预后预测方面的强大功能，突出了免疫TME在预测患者存活率中的重要性。
分析流程
到这里这篇文章已经分享完了，如果你意犹未尽的话，不防再来回顾一下全文的分析流程：
可以看出来本文的分析流程并不复杂，作者从多个角度，利用多种分析方法研究了弥散性低级神经胶质瘤的肿瘤微环境差异，鉴定并验证了其肿瘤分型，开发了具有更好预后预测功能的免疫标志物，对LGG患者进行免疫治疗具有重要的指导意义。作者的研究思路和分析方法非常值得借鉴，感兴趣的小伙伴可以仔细研读！