2020-02-19--文献阅读笔记--单细胞--休眠MM基因特征--2019 Jul 4

A niche-dependent myeloid transcriptome signaturedefines dormant myeloma cells ；2019 Jul 4；Blood--17.5

思路

利用基因标记等将所需要的研究的细胞筛选出来进行测序→MM细胞的特征性表达特征→MM细胞髓样细胞信号特征的表达→谈久了MM细胞的来源→显微镜和免疫组化研究MM细胞空间组学→研究MM细胞休眠的分子机制

一、摘要

耐药休眠骨髓瘤细胞居住在骨骼内舒适的位置是疾病复发的基础，我们建立了一种从荷瘤小鼠骨骼中提取单个休眠性髓瘤细胞的转录组序列的方法。这种休眠性骨髓瘤细胞富含免疫基因和骨髓细胞分化相关的基因。这些基因通过与成骨细胞共培养启动。以休眠细胞高表达的AXL基因为靶点，利用小分子抑制剂释放休眠细胞，促进增值。通过对AXL和其共调节基因的的表达研究，发现 （健康人对照组和意义不明的单克隆丙种球蛋白病患者） 比 （多发性骨髓瘤患者） 有着更高水平表达的休眠相关基因。在多发性骨髓瘤患者中，这种（髓样转录组标志的表达--休眠标记）转化为两倍总体生存时间的提高。表示这种休眠特征可能含有疾病进展的标志和潜在的药物治疗靶点。
小结：骨髓瘤细胞和称骨细胞生态的结合所特征表达出来的休眠相关的基因集与疾病进展相关，并有可能成为潜在的药物治疗靶点。

二、介绍

①多发性骨髓瘤（Multiple myeloma-MM）是一种B细胞肿瘤，恶性浆细胞扩散到骨骼并引起疾病
②这些长期存在于生态位（niche-resident）的休眠MM细胞逃避免疫系统并抵抗细胞毒性化疗
③染料保留策略--（在细胞分裂过程中，膜染料与子细胞共享）可以标记不分裂，休眠的MM细胞；当与纵向活体内成像（longi-tudinal intravital imaging）相结合时，这些方法可用于以单细胞方法来绘制休眠细胞的命运。利用这些方法，我们发现MM细胞在内骨表面播种并与骨衬里细胞（bone-lining cells）相互作用，从而使MM细胞进入休眠状态。
④破骨细胞重塑骨表面引起的骨内生态位的改变，使MM细胞从生态位中移位，使得MM细胞被激活
⑤我们还不清楚骨髓内骨细胞如何使得MM细胞休眠的。我们假设休眠细胞表达的转录控制程序可以识别控制MM细胞休眠的功能途径
⑤我们使用了2种完整的scRNAseq技术：SMART-seq用于全长转录组分析，而massively-parallel-scRNA-seq（MARS-seq）用于高通量分析，我们发现休眠MM细胞表现出一种独特的转录特征，表达与骨髓细胞系分化相关的免疫基因。靶向休眠细胞中表达最高的基因之一酪氨酸激酶AXL，使MM细胞从休眠状态中释放出来，增加体内MM的负荷。休眠转录组sig的性质将具有不确定意义的单克隆丙种球蛋白病（MGUS）患者与显性MM患者区分开来，并且与总生存率的两倍增加相关.

三、方法

1、细胞系
2、小鼠模型
3、scRNA-seq
4、差异基因表达分析
5、功能注释分析和聚类分析
6、转录因子预测分析
7、髓系标志物的验证
8、AXL抑制研究
9、骨结构的显微ct研究
10、活体双光子显微镜
11、共培养试验
12、髓系基因表达的实时定量聚合酶链反应分析（PCR）
13、AXL在患者样本中的表达
14、最近邻分析
15、生存分析
16、量化与统计分析

四、结果

1、休眠和重激活的MM细胞的单细胞转录组学分析

①通过表达eGFP和保留DiD鉴定休眠的MM细胞；重激活的细胞表达eGFP但DiD被稀释掉。

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②每个细胞评估到了约4000个基因
③加入到的Spike–in molecules 数量与被检测到的Spike–in 平均读书成正比，--质控
④休眠型和再激活型MM表现出相同的相似的RNA多样性（各RNA种类所占比例类似）

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⑤所有单细胞表达GFP，证明MM被分离
⑥每个细胞还表达GHV1-54重链和GKV10-96轻链可变区基因，证明它们表达克隆型B细胞受体基因（图1F）。我们还从单个休眠和再激活细胞构建了整个可变区基因序列，与亲本细胞相同（图1G）

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⑦单细胞还表达血浆细胞标记物，但不表达原始B细胞标记物。
⑧这些数据表明只有真正的MM细胞被分离和测序。

2、休眠的MM细胞表达一种不同基因的信号

①休眠和再激活MM细胞差异分析鉴定出了1492个差异基因。
②GO分析：休眠MM细胞富集到了干扰素应答、免疫应答、炎症应答；再激活MM细胞富集到DNA转录、磷酸化、转录调控。

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③非负矩阵因子分析这些细胞聚类成三个不同的群：两个休眠细胞群（C1和C2）和一个再激活细胞群（C3）
④C1亚群特征基因与干扰素信号和髓系信号相关，且15%的基因受到irf7和Spic的调控。
⑤因此休眠MM细胞的基因特征为免疫相关及髓细胞分化

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3、休眠MM细胞表达髓样转录组信号

①MARS-seq在一个更大的数据集上验证了休眠的细胞转录组特征。
②t-分布式随机邻居嵌入法（t-SNE）将MARS-seq数据分为3个簇C0、C1主要是eGFP+DiDneg 和少量eGFP+DiDhi，少量的DiD表明他们是最近被激活的，还有一些DiD未被稀释；C2是eGFP+DiDhi，证明这是原始休眠细胞群
③三者间有差异标的基因总共为602个基因，其中C0和C1富集到细胞周期和DNA修复，表明C0和C1为再激活细胞。C2在免疫过程中得到富集，MARS-seq富集到的前20的基因中的19个也被SMART-seq鉴别到，这20个基因中包含髓系细胞分化相关的基因。（功能分析，表达量前20基因分析）

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④（CD138+ eGFP+ DiDhi dormant cells ）和（CD138+ eGFP+ DiDneg reactivated cells） 进行流式细胞分析；AXL、CSF1R、FCER1G和SIRPA蛋白的表面表达在休眠细胞中均高表达。
⑤这些方法表明，休眠的MM细胞表达一系列与髓样细胞分化相关的基因，在细胞被重新激活增值时，这些基因在会下调 。

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4、休眠髓系转录组信号源于供体MM细胞和非原始髓系细胞

①休眠细胞的髓系信号有可能是以下情况：即宿主巨噬细胞吞噬了正常的MM细胞，MM细胞吞噬了宿主髓样细胞（癌细胞自相残杀），或者MM细胞与髓样细胞融合，形成混合宿主癌细胞。
②被巨噬细胞吞噬的MM细胞不会增殖。
③将分离出的再激活和休眠细胞单个分离到96孔板培养皿中，EGFP阳性细胞和EGFP阴性细胞均能形成菌落。AXL、SIRPA和fcer1g在形成集落的细胞和未形成集落的细胞之间的表达相似。这些数据证实休眠细胞可以形成菌落，认为它们没有被巨噬细胞吞噬。
④为了确定与宿主细胞的融合是否会产生髓样信号。
我们利用了5TGM1细胞来源于雌性小鼠的知识。
将DiD标记的5TGM1eGFP细胞注射到雄性和雌性小鼠体内。然后我们分析了1571Y染色体基因的表达。阳性对照细胞（RM1前列腺细胞）的分析显示Y染色体基因的表达（图4E-H）。相反，从雌性或雄性小鼠中分离出来的休眠或再活化的骨髓细胞均未表达任何1571个Y染色体转录本（图4F-H）。
这些数据证实MM细胞而不是宿主细胞是髓系转录组信号的来源。

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5、骨髓细胞中髓样基因的生态位依赖性诱导

①活体双光子显微镜和免疫组化显示休眠MM细胞位于骨内膜附近，被成骨细胞系分化细胞覆盖。

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②TGM1eGFP（MM）与MC3T3（成骨细胞系）进行共培养，三天后，APL、Mpeg1、Sirpa和CSF1R的表达上调。AXL的表达被流式细胞仪实验所验证。

③RNA-seq显示共培养1156个gene表达上调，1个gene下调
④成骨细胞表达关键休眠信号基因的结合伙伴，包括gas6和4b1；相比于共培养，没有表达上的差异
⑤ 这些观察结果表明，股内膜inhce细胞能够诱导MM细胞中的（类髓质转录组特征基因）的（接触依赖性上调）以诱导休眠

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6、抑制AXL释放MM细胞休眠

①休眠细胞中一个高度上调的基因是axl，它被选为功能概念的证明分析。我们使用了2种抑制剂：卡博扎尼和BMS-777607。除了LT3外，卡波扎替尼的靶点未被休眠或重新激活的细胞表达。

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②失活的Axl解除了休眠的细胞并使MM细胞增值
③减少的细胞数量与增加的肿瘤负荷所需的细胞数量一致
④在脾脏中，卡博替尼治疗对休眠细胞数没有影响，只是轻微增加了MM负荷
⑤BMS-77760对AXL亲和力更高，BMS-777607治疗也减少了骨髓中的EGFP+DiD阳性细胞，增加了EGFPDiD阴性细胞的负荷，但脾脏没有发现。

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⑥鉴于破骨细胞吸收能使休眠MM激活，测定BMS-777607是否能间接增加破骨细胞来释放休眠MM细胞。在小鼠中，BMS-777607对别破骨细胞占据的骨表面没有影响。

⑦AXL能够使得MM细胞处于休眠状态中

7、AXL由人骨髓浆细胞和MM细胞表达

①作者研究了骨髓 microenvironment、B–cell lineage、MM的ALX的表达；AXL仅在间充质细胞和成骨细胞中表达；一小群CD138+CD38+浆细胞也表达AXL；
MGUS患者的Axl1细胞比例高于MM或复发MM患者，且疾病负担与Axl1细胞频率呈负相关
②提示AXL和髓系休眠信号基因编码的蛋白可能是一个（人休眠MM细胞亚群）

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8、休眠髓细胞转录组特征基因可能与生存相关

①用最近邻分析法（NNA--nearest-neighbor）确定了axl共调控基因；且通过分层聚类分析，AXL共调节基因可以将患者区分对照组、MGUS患者和MM患者

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②在一项使用地塞米松或硼替佐mib治疗的临床试验，我们分析了患者血浆细胞转录组中休眠MM细胞信号基因的表达。与低信号基因表达的患者相比，高表达休眠细胞转录组信号的住院患者的中位生存率增加了近两倍
③overall surviva（总体生存）、Event-free survival（无事件生存）
④临床协变量的单变量和多变量Cox回归分析表明休眠标志是一个预后标志
⑤某些数据库可能没有表现 休眠signature 得到差异的生存。这可能是由于患者和治疗的异质性，不像金标准随机对照试验。

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五、讨论

①在这项研究中，我们定义了一个休眠的MM细胞转录组信号，一个由休眠的MM细胞表达的基因目录，当它们被激活并转变为活跃生长的MM时，这些基因被关闭。
②骨内生态位调控着【（骨髓瘤细胞中）控制细胞休眠的髓样基因库】
③在实体癌中抑制AXL可降低肿瘤负担
④目前的研究表明，抑制AXL可以使细胞从休眠状态中释放出来，并使其对化疗敏感
⑤使用AXL作为概念证明，患者血浆细胞含有罕见的Axl1细胞亚群
⑥MGUS患者的Axl1细胞比例高于MM患者，而复发性疾病患者的Axl1细胞比例最低；这使得可以通过对AXL及其共调解的基因进行层次聚类将这些患者区分开来。

一些查找的知识点

1、RNA spike-in
①RNA spike-in 最开始是由 ERCC（External RNA Control Consortium）RNA外部质控组织开发的，有点类似于色谱中添加的标准品，以便定量分析，标化不同样品之间的 RNA counts —— 通过与已知浓度的对照进行比对，借助 RNA 测序的方法对基因表达进行定量分析。
②这在单细胞 RNA 测序实验中尤为重要，因为单细胞实验中要求对数千个细胞 mRNA 数据进行比对，而每个细胞的 mRNA 的组成，以及实验的误差给实验结果带来的影响都差异极大。
③通过加入定量的 RNA spike-in，便可以根据文库中 spike-in 占总 RNA transcripts 的比例估计出每一个细胞内 mRNA的含量。如果比例过高，则通常说明细胞 RNA 的含量较低，或者实验出了问题。这些比例高的数据也是在质量控制中需要剔除的。
2、抗体可变区
抗体大致结构式相同的，但是有可变区，根据抗原的不同有着不同 的可变区。可变区基因编码可变区。可变区的基因数量很多，但是如果是一个全新的抗原，要产生抗体的话，就需要可变区基因发生突变。