5+铜死亡+单基因泛癌生信思路

今天给同学们分享一篇铜死亡+单基因泛癌的生信文章“Pan-cancer integrated bioinformatics analysis reveals cuproptosis related gene FDX1 is a potential prognostic and immunotherapeutic biomarker for lower-grade gliomas”,这篇文章于2023年2月7日发表在Front Mol Biosci期刊上,影响因子为5。
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FDX1参与了铜相关的细胞死亡方式——铜死亡,这可能会影响肿瘤进展,如铁死亡和焦亡。然而,FDX1在肿瘤中的作用仍需探索。本研究从泛癌症的角度,基于综合生物信息学,调查了FDX1的表达特征以及与预后、肿瘤分期、免疫微环境和铜死亡的相关性。


1. FDX1模式的表达及其在泛癌症中的临床特征

首先,为了研究FDX1在肿瘤和正常组织中的差异表达,作者从TCGA数据库获取了FDX1的mRNA表达数据。差异表达分析结果显示,在胶质母细胞瘤(GBM)、脑低级别胶质瘤(LGG)和胃腺癌(STAD)中,FDX1在肿瘤组织中的表达水平高于正常组织(图1A)。而在乳腺浸润性癌(BRCA)、胆管癌(CHOL)、结肠腺癌(COAD)、肾嗜铬细胞瘤(KICH)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、肺腺癌(LUAD)、肺鳞状细胞癌(LUSC)、前列腺腺癌(PRAD)、直肠腺癌(READ)和甲状腺癌(THCA)中,肿瘤组织中FDX1的表达水平降低(图1A)。接下来,作者根据GTEx数据集分析了FDX1在正常组织中的表达情况。结果显示,肾上腺、肝脏和甲状腺中FDX1的表达水平较高,而血液、大脑和胰腺中的表达水平较低。然后,肿瘤细胞系中FDX1表达的结果显示,根据CCLE数据库,它在肠道、胃、造血和淋巴组织中表达最高,在胸膜和上呼吸道中表达最低。

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图1 根据癌症基因组图谱(TCGA)和基因型组织表达(GTEx)数据库,FDX1在人类泛癌中的差异表达情况


由于TCGA数据库中正常样本数量较少,作者进一步整合了TCGA和GTEx数据库来评估FDX1的差异表达。如图1B所示,FDX1在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺癌(BRCA)、宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌(CESC)、结直肠腺癌(COAD)、食管癌(ESCA)、胶质母细胞瘤(GBM)、肾上腺皮质肿瘤(KICH)、急性髓系白血病(LAML)、低级别胶质瘤(LGG)、肝细胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、卵巢浆液性囊腺癌(OV)、胰腺腺癌(PAAD)、前列腺癌(PRAD)、皮肤切除性黑素瘤(SKCM)、胃腺癌(STAD)、睾丸生殖细胞肿瘤(TGCT)、甲状腺癌(THCA)和子宫肉瘤(UCS)中上调,在胆管细胞癌(CHOL)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾盂细胞癌(KIRP)、肺鳞状细胞癌(LUSC)和直肠癌(READ)中下调。在肾上腺皮质癌(ACC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSC)和子宫体内膜癌(UCEC)中,FDX1的表达没有差异(图1B)。


此外,作者根据GEPIA2.0在不同癌症阶段探索了FDX1的表达情况。结果显示,FDX1在甲状腺癌(F值=11,Pr(>F)=5.15e-07)、肝细胞癌(F值=6.11,Pr(>F)=0.000467)、肾透明细胞癌(F值=5.7,Pr(>F)=0.000759)、胰腺导管腺癌(F值=4.96,p=0.00253)、直肠癌(F值=4,Pr(>F)=0.0105)、肾盂癌(F值=3.34,Pr(>F)=0.0199)、食管鳞状细胞癌(F值=3.26,Pr(>F)=0.023)和肾上腺皮质癌(F值=2.81,Pr(>F)=0.0469)中表达差异显著(图2)。其他肿瘤阶段,如肾上腺皮质癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌等,FDX1的表达没有差异。

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图2 FDX1表达与肿瘤分期之间的相关性


采用单变量Cox比例风险模型来探索FDX1的生存预测价值。通过OS、DSS和PFI评估FDX1的预后价值。OS结果显示,在胶质瘤(GBMLGG)中,FDX1的表达是一个风险因素(HR = 4.17,p = 1.7e-19),在低级胶质瘤(LGG)中也是一个风险因素(HR = 2.92,p = 9.5e-6),而在肾透明细胞癌(KIRC)和全肾癌队列(KIPAN)中是一个保护因素(HR = 0.48,p = 1.3e-8;HR = 0.59,p = 8.1e-8)(图3A)。DSS结果表明,在GBMLGG(HR = 4.64,p = 2.0e-20)、LGG(HR = 2.97,p = 1.5e-5)、黑色素瘤(SKCM)(HR = 1.72,p = 0.04)、KIRC(HR = 0.38,p = 6.1e-10)、KIPAN(HR = 0.50,p = 7.6e-9)、KIRP(HR = 0.56,p = 0.03)和胸腺瘤(THYM)(HR = 0.33,p = 0.03)中,FDX1与DSS相关。PFI的分析结果也表明,在肾上腺皮质癌(ACC)中,FDX1也是一个风险因素(HR = 1.34,p = 4.2e-3),而在甲状腺癌(THCA)(HR = 0.46,p = 1.6e-3)和间皮瘤(MESO)(HR = 0.54,p = 0.03)中是一个保护因素。然后,Kaplan-Meier曲线显示,FDX1的高表达与GBMLGG(HR = 3.45,p = 4.4e-18)和LGG(HR = 2.48,p = 8.1e-7)的不良预后相关,与KIPAN(HR = 0.4,p = 1.67e-7)和KIRC(HR = 0.45,p = 1.1e-7)(图3B-E)。同时,作者分析了FDX1的表达与GBM、KICH和KIRP的预后之间的关系。结果显示,FDX1的高表达与GBM(HR = 1.4,p = 0.11)和KICH(HR = 3.53,p = 0.05)的不良预后相关,与KIRP(HR = 0.54,p = 0.04)的良好预后相关。总之,这些结果明显反映了FDX1的高表达是LGG的重要风险因素,同时也是KIRC的保护因素,影响了GBMLGG和KIPAN的预后。

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图3 根据TCGA泛癌症数据库,对FDX1在不同癌症类型中的总体生存(OS)进行分析


2. FDX1表达与泛癌免疫特征之间的相关性

为了探索铜死亡是否与肿瘤免疫微环境有关,作者研究了铜死亡核心蛋白FDX1与免疫的相关性。首先,作者使用TIMER算法(Li等,2017)探索了FDX1与免疫细胞浸润之间的相关性。在多种癌症中,特别是在LGG中,FDX1表达与B细胞、CD4 T细胞、CD8 T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(DC)浸润呈正相关(图4A)。除了CD4 T细胞外,FDX1还与PRAD、KIRC中的其他免疫细胞呈正相关(图4A)。另外,在STAD中,FDX1表达与CD4 T细胞、CD8 T细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞呈负相关(图4A)。基于ESTIMATE分析,进一步研究了FDX1表达与肿瘤环境之间的相关性(Yoshihara等,2013)。在LGG和GBMLGG中观察到FDX1表达与StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore之间强烈的正相关(图4B-D),而在KIRC和KIPAN中观察到负相关(图4B-D)。然而,在GBM中没有显著的相关性。

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图4 FDX1与泛癌症中免疫细胞浸润、LGGGBM、LGG、KIPAN和KIRC中的基质得分、免疫得分和ESTIMATEScore之间存在相关性


免疫检查点、肿瘤干细胞性质、同源重组缺陷(HRD)、TMB、MSI、DNMT和MMR是免疫治疗和辅助治疗的重要评估标志,可以预测治疗效果和患者的预后(Chiappinelli等,2016年;Luchini等,2019年;Clara等,2020年;Morand等,2021年)。因此,作者确定了FDX1表达与这些标志之间的相关性。在LGG、TGCT和UVM中,FDX1表达与大多数免疫检查点呈正相关,而在THCA和THYM中与大多数免疫检查点呈负相关(图5A)。具体而言,在LGG中,CD276(B7-H3)、CD274(PD-L1)、PDCD1LG2(PD-L2)、CTLA4、HAVCR2和PDCD1(PD-1)与FDX1强相关(图5A)。此外,肿瘤干细胞性质相关分析表明,FDX1表达与多种肿瘤类型的干细胞性质评分相关(图5B)。值得注意的是,在GBMLGG和LGG中观察到强正相关,而在GBM中没有观察到显著相关(图5B)。HRD相关分析显示,FDX1表达与14种肿瘤类型的HRD显著相关(图5C)。类似地,在GBMLGG(p = 0.00005,R = 0.16)和LGG(P = p = 2.30e-7,R = 0.23)中观察到了强烈的正相关性,而在GBM中没有观察到显著的相关性(图5C)。同时,在KIPAN(p = 7.85e-7,R = -0.19)和KIRC(p = 0.0005,R = -0.16)中观察到了强烈的负相关性(图5C)。

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图5 FDX1表达与免疫检查点、DNA甲基化数据得出的干细胞程度评分以及同源重组缺陷(HRD)之间的关系


此外,作者的结果显示,FDX1与TMB、MSI、DNMT和MMR在多种肿瘤类型中密切相关。在TMB的分析过程中,结果显示FDX1与ESCA、HNSC、LGG、LUSC、STAD和UCEC中的TMB呈正相关,与KIRC、LUAD、THYM和THCA中的TMB呈负相关(图6A)。在DLBC、HNSC、KIRC、STAD和UCEC中观察到FDX1表达与MSI呈正相关(图6B)。而在LUAD、LUSC、PAAD和SKCM中,FDX1与MSI呈显著负相关(图6B)。作者研究了基于MLH1、MSH2、MSH6、PMS2和EpCAM等五个基因的FDX1表达与MMR的关联。结果显示,FDX1表达与ACC、BLCA、CESC、COAD、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LGG、LUSC、OV、PRAD、READ、THCA、UCEC和UVM中的MMR密切相关(图6C)。作者还研究了FDX1与DNA甲基化的关系,后者对于表观遗传学至关重要。作者分析了FDX1与包括DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B在内的四种甲基转移酶的关系。结果表明,在THYM、UCEC、UVM和LGG中,FDX1与DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B呈正相关(图6D)。除了DNMT2之外,FDX1与GBM中的其他甲基化转移酶呈负相关(图6D)。

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图6 FDX1与肿瘤突变负荷(TMB)、微卫星不稳定性(MSI)、错配修复(MMR)和DNA甲基转移酶(DNMT)之间的相关性


3. 验证FDX1表达及其与脑低级别胶质瘤相关的肿瘤特征

根据以上结果,作者发现FDX1表达与预后、免疫浸润以及免疫治疗相关因素(包括免疫检查点、肿瘤干细胞性质、HRD、TMB、MMR和DNMT)在低级胶质瘤中具有显著相关性。因此,作者进一步根据中国低级胶质瘤基因组图谱数据库(CGGA)验证了FDX1在低级胶质瘤中的促肿瘤作用。针对临床特征,作者发现WHO II级、WHO III级和WHO IV级(p = 0.001)中FDX1表达存在显著差异,且FDX1在WHO IV级(GBM)中高表达,相比于WHO II级、III级(LGG)(图7A),与TCGA-GBM和TCGA-LGG的结果一致(图1A、B)。异染色酸脱氢酶(IDH)突变状态和1p/19q共缺失状态是评估胶质瘤诊断、预后和治疗情况的重要因素。作者发现FDX1在IDH野生型患者中高表达(p = 0.0052),在1p/19q非共缺失患者中高表达(p = 3.6e-09)(图7B、C)。随后,作者还说明了FDX1在不同的胶质瘤分子亚型中表达差异,包括LGG IDH突变-1p/19q编码型、LGG IDH突变-1p/19q非编码型、LGG IDH突变-野生型和GBM IDH突变、IDH野生型(p = 4.6e-05)(图7D),表明FDX1在胶质瘤分子亚型中表达差异,并提示FDX1在胶质瘤的预后和治疗中可能具有潜在功能。

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图7 根据中国脑低级别胶质瘤基因组图谱数据库(CGGA),FDX1在脑低级别胶质瘤(LGG)中的差异表达情况


然后,生存分析显示FDX1的高表达是原发性胶质瘤(WHO分级)和复发性胶质瘤(WHO分级)的不良预后因素(p < 0.0001和p = 0.034)(图8A)。在不同分级中,作者的结果表明FDX1的高表达是WHO II级原发性胶质瘤(低级胶质瘤)的风险因素(p = 0.018)(图8B),这个结果与TCGA-LGG的结果相似(图3C)。然而,在WHO III级(低级胶质瘤)(p = 0.28)、WHO IV级原发性胶质瘤(高级胶质瘤)(p = 0.51)、WHO II级(低级胶质瘤)(p = 0.33)、WHO III级(低级胶质瘤)(p = 0.16)和WHO IV级(高级胶质瘤)复发性胶质瘤(p = 0.18)中,这个结果并未得到证实(图8B-D)。这些结果验证了TCGA中的生存分析结果。

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图8 基于CGGA数据库的FDX1表达在胶质瘤中的总生存(OS)分析


为了阐明FDX1对LGG存活的具体机制,GSEA分析根据TCGA-LGG和CGGA-LGG(WHO II、III级)中的高低亚组,提出了FDX1的关键生物功能。生物过程结果表明,高FDX1表达亚组主要涉及免疫介导途径,包括正调节髓样白细胞介导的免疫、巨噬细胞趋化、内源性抗原的抗原处理和呈递,以及炎症反应,例如正调节Toll样受体信号通路和基于TCGA-LGG和CGGA-LGG数据集的细胞死亡调节(图9A、B)。同时,KEGG途径显示高FDX1表达亚组参与了免疫介导途径,包括白细胞经内皮迁移和B细胞受体,与炎症相关的途径,包括Nod样受体信号通路和趋化因子信号通路,以及与代谢相关的途径,如花生四烯酸代谢(图9C、D)。随后,对Hallmark途径的分析有助于研究与肿瘤相关的途径。作者的研究结果表明,FDX1基因组的高表达主要与活性氧(ROS)途径、TGF-β信号通路和蛋白质分泌有关。根据TCGA-LGG和CGGA-LGG数据库的数据(图9E,F),低FDX表达与KRAS信号通路有关。值得注意的是,这些结果反映了FDX1的生物功能涉及免疫介导的途径、炎症、代谢和细胞死亡相关的途径。

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图9 FDX1基因的生物功能在TCGA和CGGA数据集中显示在LGG的生物过程(BP)途径、KEGG途径和Hallmark途径中


作者进一步验证了CGGA数据集中FDX1表达与免疫浸润之间的相关性。结果表明,在CGGA-LGG数据库中,FDX1与ESTIMATEScore(R = 0.39,p = 4.9e-8)、ImmuneScore(R = 0.39,p = 6.2e-8)和StromalScore(R = 0.37,p = 2.3e-7)呈正相关(图10A),与TCGA-LGG的结果一致(图4B-D)。在CGGA-GBM数据库中,FDX1与ESTIMATEScore(R = 0.16,p = 0.06)、ImmuneScore(R = 0.15,p = 0.07)和StromalScore(R = 0.16,p = 0.06)之间没有差异(图10B),与TCGA-GBM的结果一致。然后,相关分析显示,在TCGA-LGG(图10C)和CGGA-LGG数据集(图10D)中,FDX1表达与DC、中性粒细胞、巨噬细胞、CD4 T细胞和B细胞呈正相关。此外,在CGGA-LGG数据集中,FDX1表达与许多免疫检查点呈正相关,其中CD274、CD276、HAVCR2、ICOS和PDCD1LG2与FDX1表达在TCGA-LGG和CGGA-LGG数据集中均呈正相关。

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图10 基于TCGA和CGGA数据库以及CGGA数据库中的StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore,FDX1与LGG中的免疫细胞浸润相关


4. FDX1与其他与铜死亡相关基因之间的相关性

作者采用相关性分析来阐明FDX1与铜死亡相关基因之间的关系。作者的结果表明,在TCGA-LGG数据集中,FDX1表达与铜死亡抑制基因ATP7B呈负相关,与铜死亡促进基因SLC31A1呈正相关,与铜死亡必需基因二硫辅酶S-乙酰转移酶(DLAT)、二硫辅酶脱氢酶(DLD)、硫辅酶合酶(LIAS)、脂肪酰转移酶1(LIPT1)呈正相关(图11A)。在CGGA-LGG数据集中,作者观察到FDX1表达与SLC31A1、DLAT、DLD和LIPT1之间存在类似的正相关关系(图11B)。但是,FDX1表达与ATP7B和LIAS之间没有差异。

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图11 FDX1表达与铜死亡相关基因之间的相关性


总结

在作者的研究中,作者探讨了FDX1在TCGA人类泛癌中的作用,包括临床和免疫学特征。特别地,作者发现FDX1是一个预后不良的预测因子,并与CGGA的免疫微环境相关。FDX1与免疫治疗预测的标志物,包括免疫检查点、肿瘤干细胞、HRD和TMB,有密切关联,这表明它可能作为免疫治疗预测因子的潜在作用。总的来说,作者的研究应用了泛癌生物信息学分析,并发现FDX1可能被视为LGG中潜在的预后不良生物标志物和免疫治疗预测因子。但以上所有结果仍需要进一步的实验验证。

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