质粒转化与质粒小提/大提

质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体（或拟核）以外的DNA分子，存在于细胞质中（但酵母除外，酵母的2 μm质粒存在于细胞核中），具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息，是闭合环状的双链DNA分子。质粒不是细菌生长繁殖所必需的物质，可自行丢失或人工处理而消除，如高温、紫外线等。质粒携带的遗传信息能赋予宿主菌某些生物学性状，有利于细菌在特定的环境条件下生存。

质粒具有自主复制能力，使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。细菌质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。

准备工作：

配制LB Agar固体培养基（琼脂糖浓度最好为2%），配制LB液体培养基，50%甘油（用超纯水配制，用来保存菌种），高压灭菌，待温度冷却至50℃以下，往培养基中加入相应浓度的抗性(液体培养基可后面再加)；
同时高压灭菌相应的EP管，Tips，锥形瓶等；
准备超净台：移液器，枪头，酒精灯，打火机，10cm培养皿等，照紫外；
在超净台中点燃酒精灯，倒平板，约15ml/皿，用封口膜封好平板，放在4度中冷却成型；

质粒转化

1. 取1.5ml EP管，加30ul TE Buffer，将带有质粒的滤纸浸泡其中，4℃冰箱静置 >4h。
2. 将TransStbl3 Chemically Competent Cell(Lot# M230524) 感受态冰浴解冻，轻弹匀。
3. 取1.5ml EP管加入10ul 感受态 + 2ul 步骤1中的质粒。（最好设置一个阴性对照）
4. 42℃ 水浴热激45s，快速转移到冰上静置2min。（这个步骤不要晃动EP管）
5. 向每个步骤3中的EP管中加入20ul 的无菌LB液体培养基(还未添加抗性)，使细菌复苏，混匀后于30℃(这个温度取决于感受态的最适宜生长温度)，225rpm摇床摇20min(这个时间要根据经验，时间应把握在刚好涂板子可以长出比较好的单菌落，太短菌液浓度太低，长菌落慢且太少；太长菌液浓度太高，菌落大，单菌落不好挑)。
6. 在超净台中，将冷却好的固体培养基打开吹干，每个皿中加入100ul菌液涂板子，注意分区，连续涂板，封口膜封好板子，30℃培养箱，倒置培养16-20h，看到长出小菌落时将板子放入4℃保存。

质粒小提

7. 将之前准备的LB液体培养基中加入抗性(氨苄1：1000)，取15ml 离心管，加入5ml 已加入抗性的液体培养基。
8. 用小白Tips从平板中挑选单克隆，将小枪头打入15ml 离心管中，30℃，180rpm，摇 >5h，以看到液体培养基变浑浊为准。
9. 取干净的1.5ml EP管，从15ml 离心管中吸取1.5ml(这个量可根据菌液混浊程度加减)菌液，12000rpm，离心3min。
10. 弃上清，加入250ul TIANGEN质粒小提Kits(Cat# DP103-03，Lot# 6123)P1液，震荡，彻底混匀。
11. 加入250ul P2液，温和(以免DNA断裂)翻转6-8次，使菌体充分裂解。（这一步总时间不要超过5min，防止过度裂解，质粒受到破坏）
12. 向EP管中加入350ul P3液，立即温和上下翻转6-8次，充分混匀，此时可看到白色絮状沉淀，12000rpm，离心3min。（P3加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀，若上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）
13. 将吸附柱CP3(实验前用平衡液BL处理吸附柱可最大限度激活硅基质膜，提高得率；BL处理过的吸附柱最好当天使用，放置时间过长会影响效果)放在收集管中，将上清转移到吸附柱CP3中，尽量不要吸到沉淀，12000rpm，离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管。
14. 可选步骤：向CP3中加入500ul去蛋白液PD，12000rpm，离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管。（如果宿主菌是end A+ 宿主菌TG1、BL21、HB101、JM系列、ET12567等，因其含有大量核酸酶，所以推荐此步骤；若为end A- 宿主菌DH5α、TOP10等，可省略此步）
15. 向CP3中加入600ul 漂洗液PW(已加入无水乙醇)，12000rpm，离心30-60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管。
16. 重复步骤15。
17. 12000rpm，离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去掉。
18. 将CP3吸附柱放入一个干净的1.5ml EP管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100ul洗脱液EB，室温放置2min，12000rpm，离心2min，将质粒溶液收集到EP管中。（为增加质粒得率，可将溶液再次加入吸附柱CP3，室温放置2min，12000rpm，离心2min，将质粒溶液收集到EP管中；也可以提前65-70℃预热EB液）
19. 测浓度，跑胶看提取质粒的质量。

质粒大提

质粒大提前一般要质粒小提确认质粒的质量

20. 取洁净的锥形瓶，加入步骤7中的LB液体培养基100ml，取步骤8中的菌液10ul 加入锥形瓶中，30℃，180rpm，摇过夜，以看到液体培养基变浑浊为准。
21. 保存菌种：用15%的甘油保存菌种：1.5ml EP管中加入350ul 菌液+150ul 50%甘，混匀，-80℃保存。
22. 将锥形瓶中剩下的菌液用50ml 离心管，4℃，8000rpm，离心5min，收集菌体沉淀，可同管多次。
23. 根据所选大提试剂盒的说明书按步骤提取，不同试剂盒步骤不一样。
24. 提取结束后测浓度，跑胶（因质粒分子量一般较大，所以用低浓度的琼脂糖胶和大的marker）

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