Hello，新年伊始，相信还是有很多和小编一样又在科研岗位坚（hua）守（shui）的小伙伴们，为了毕业，该啃的文献还是得啃啊，今天就向大家介绍一篇2021年1月27日刚发表在Clinical Cancer Research杂志(IF=10.107)的文章，本文鉴定并分析了三种转录亚型【粘液型(MUC亚型)，增生型(PRO亚型)和间质型(MES亚型)】在肺腺癌中的临床意义。文章新鲜出炉，内容需要细嚼慢咽！
在正式开始介绍本文之前，小编要先简单向大家介绍一下本文中出现的队列研究：
1. OAK研究(NCT02008227)[1]：一项随机、开放、在31个国家194个中心开展的临床III期研究，主要评估阿特珠单抗(Atezolizumab)对比多西他赛(Docetaxel)治疗曾经治疗失败的非小细胞肺癌的有效性与安全性。患者1:1随机分配接受Atezolizumab 1200mg，q3w或多西他赛75mg／m^2，q3w治疗；
2. POPLAR研究(NCT01903993)[2]：一项开放标签式、随机对照II期临床研究，涵盖欧洲和北美13个国家共61个医学研究中心，该研究评估了阿特珠单抗(Atezolizumab)和多西紫杉醇(Docetaxel)在经治NSCLC患者中的安全性和有效性。患者随机分为 Atezolizumab（1200mg/次）组和多西紫杉醇（75mg/m2）组，两组用药方式均为静脉注射，用药时间为每三周一次。
3. gp28363研究(NCT01988896)[3]：一项全球I / Ib期研究，主要探索 MEK抑制剂卡比替尼(cobimetinib)联合PD-L1抑制剂阿特珠单抗(atezolizumab)在实体瘤患者中的安全性和临床活性，包括28例NSCLC患者。大多数患者中，卡比替尼每天口服给药21天，休息7天。Atezolizumab每2周静脉注射800mg。
对本文中出现的队列研究有了一定了解以后，是不是更加迫不及待的想要一睹正文的风采了呢，话不多说，直接上大招~
1.三种转录亚型捕获肺腺癌的异质性
先前有研究报道[4]，在68例肺腺癌中通过共识NMF聚类确定了KRAS突变的三个健壮且可重现的亚型KC(仅KRAS突变)、KP(KRAS/TP53共突变)和KL(KRAS与STK11/LKB1共突变)。基于以上报道的研究结果，作者对来自TCGA的128例原发性KRAS突变肺腺癌进行了新的亚型鉴定，结果表明在该患者队列中，三个亚型足以捕获转录异质性(补充图S1A)；此外，作者发现新鉴定的亚型与先前研究报道的亚型强烈重合(91％的一致性；补充图S1B），证实了这些亚型对原发性、治疗性、KRAS突变型肺腺癌肿瘤的有效性。
补充图S1(A-B)
鉴于以上发现，作者进一步研究了晚期和转移性KRAS突变型肺腺癌患者的转录异质性。RNA测序数据来自OAK队列中138例KRAS突变、非鳞状肺癌患者(62％原发性肿瘤和38％转移性肿瘤)，结果再次表明新鉴定的三种亚型可以捕获转录异质性（补充图S1C），与先前研究报道亚型高度重合 (89％的一致性；补充图S1D），同样证实了三种亚型对于晚期或转移性KRAS突变型肺腺癌的有效性。
补充图S1(C-D)
验证新鉴定的亚型的有效性后。作者从TCGA和OAK队列中使用4倍大且涵盖范围更广的原发性，晚期和转移性KRAS突变型肺腺癌肿瘤，鉴定了有力且广泛适用的113个基因签名(图1A, 补充图S1E–S1G)。作者将这些亚型称为粘液型（MUC，亚型1），增生型（PRO，亚型2）和间质型（MES，亚型3）。
图1A+补充图S1(E-G)
除了KRAS突变的患者亚群以外，大多数KRAS野生型肺腺癌肿瘤都缺乏已知的治疗脆弱性，因此，作者评估了这三种亚型是否适用于KRAS野生型肺腺癌，结果表明来自TCGA的282例KRAS野生型肺腺癌中的231例（占82％）可以确定地归为其中某一种亚型（图1B；补充图S1H）。另外，KRAS突变患者亚群中各亚型的分配与在KRAS患者亚群中各亚型的分配之间的一致性达到了87％，从而证实了新确定的肺腺癌转录亚型在KRAS突变患者亚群以外群体中的适用性（补充图S1I）。
图1B+补充图S1(H-I)
在OAK队列中，73% (189/258) KRAS野生型非鳞状肺癌也可归属于某一确定的亚型(图1C，补充图S1J和S1K)，同样适用于原发性(107/148,72%)和转移性组织样本(82/110,75%)。
图1C+补充图S1(J-K)
为了广泛地表征这三种肺腺癌亚型的生物学特性，作者分别对KRAS突变型和KRAS野生型肿瘤的TCGA和OAK队列进行了基因富集分析（补充图S2）。PRO亚型肿瘤中炎症、免疫应答和KRAS信号相关基因始终呈现低表达，而氧化磷酸化、E2F靶标、G2/M期检查点、MYC靶标相关的基因始终呈现高表达。对于其他两种亚型肿瘤，细胞周期相关基因的表达水平依赖于KRAS突变状态：KRAS野生状态下，在原发性和晚期MES亚型肿瘤中表达最低；KRAS突变状态下，在晚期MUC亚型肿瘤中表达最低。
补充图S2
2.肺腺癌亚型的基因组特征
为了深入了解驱动基因突变在亚型异质性中的作用，作者评估了TCGA肺腺癌肿瘤中EGFR、MET、PI3K/AKT/mTOR和MAPK通路的变化(图1 D)。结果表明，MES亚型肿瘤中EGFR突变的发生率明显较高，而MUC亚型肿瘤相对缺乏MAPK途径改变。KRAS突变在三种亚型中均有表现，在KRAS突变的肿瘤中，个别的KRAS热点突变也是如此。与已戒烟/吸烟的人(TCGA, 38% /47%;P= 0.021和OAK，32%/ 42%，P= 0.005)相比，终生不吸烟的人(TCGA, 68%和OAK, 70%)中MES亚型占比更高，但是在KRAS野生型环境中，吸烟与KRAS突变型肿瘤的亚型没有关联。
图1D
根据先前的报道[1]，CDKN2A丢失和STK11、KEAP1、TP53突变可能定义了肺腺癌肿瘤的亚型分型，于是接下来作者分析了这些基因的变化以及它们的转录基因缺陷特征。研究发现，虽然这些基因突变在不同亚型中富集，但这些改变并不是任何一个亚型的唯一特征(图1E)。
①STK11、KEAP1突变：
KRAS野生型TCGA队列中，STK11突变的发生率在PRO亚型肿瘤中为30%，在MUC亚型肿瘤中为6%，在MES亚型肿瘤中为2%。在晚期患者中，与KRAS野生型肿瘤相比，STK11突变在KRAS突变型肿瘤中也更为明显，意味着KRAS状态的偏差。作者还发现在STK11野生型肿瘤亚群中(40% TCGA，8% OAK)，还存在KEAP1突变，但是STK11和KEAP1基因组突变既不能完全捕获也不能代表PRO亚型（图1F,补充图S3B）。此外，KRAS突变环境下，TCGA和OAK队列中分别有90％和94％的PRO亚型肿瘤，35％和52％的MUC亚型肿瘤，2％和5％的MES亚型肿瘤是STK11 / KEAP1缺陷；而在KRAS野生环境下，分别有68％和84％的PRO亚型肿瘤，35％和48％的MUC亚型肿瘤，10％和11％的MES亚型肿瘤是STK11 / KEAP1缺陷。
②CDKN2A丢失：
CDKN2A丢失在MUC亚型肿瘤中更为普遍，但与KRAS状态无关，并且CDKN2A丢失也不是该亚型所独有的。
③TP53突变：
TP53突变主要富集在KRAS突变的MES亚型肿瘤中，而在KRAS野生型状态下与亚型无关。
图1E-F+补充图S3B
此外，作者还评估了粘液分化标志物(MUC5AC、MUC5B、KRT20)的表达水平，发现这些基因在MUC亚型肿瘤中始终较高表达，而与KRAS状态无关（补充图S3C和S3D）。
补充图S3C-D
综上所述，在KRAS野生型队列中，基因突变与亚型有中度或无关联，而转录基因缺陷特征在突变型和野生型背景下都能更准确地反映亚型特征。
3. 肺癌转录异质性的临床意义取决于突变环境
作者评估了亚型多样性是否对预后具有临床意义。发现转录亚型所捕获的预后价值取决于突变背景。在原发性疾病（TCGA）中，MUC亚型与KRAS突变型肿瘤的总体生存期最差（OS）相关（补充图S3E），而在KRAS野生型肿瘤中，这种相关性未达到统计学意义（补充图S3F）。
补充图S3E-F
另外，在晚期OAK队列中，无论KRAS状态如何，在用多西紫杉醇治疗的肿瘤中转录亚型无预后价值（补充图S3G和S3H）。
补充图S3G-H
抗PD-1/PD-L1治疗耐药，作者将注意力集中在STK11的状态上。利用用III期OAK试验数据（补充表S2）来评估MUC和PRO亚型肿瘤中普遍存在的STK11突变是否预后不良。作者发现，在携带MUC和PRO亚型肿瘤的患者之间，阿特珠单抗治疗的OS没有差异（补充图S4A），但加上STK11基因组状态后，在STK11突变队列中，不管KRAS的状态如何，MUC亚型患者的生存较PRO亚型患者差（中位OS：6.2 vs. 14.3个月，补充图S4B），作者根据扩展的STK11状态验证了上述发现（补充图S4C）。
补充图S4A-C
在多西紫杉醇治疗的情况下，STK11的预后作用取决于亚型和KRAS状态。在KRAS野生型肿瘤中，STK11基因组状态为MUC和PRO亚型肿瘤的预后指标（P=0.002）（补充图S4D和S4E）。STK11基因状态在接受多西紫杉醇治疗的KRAS突变型肿瘤全队列中也是预后因素(P=0.047)。然而，在MUC亚型(补充图S4F)或PRO亚型(补充图S4G)中，STK11状态对预后没有影响，说明STK11突变与OS较差相关可以通过亚型来解释。
补充图S4F-G
总之，这些临床数据说明转录亚型可能在基因组环境下增加临床生存预后价值。
4.在多区域活检中观察到的转录同质性和遗传异质性
作者分析了POPLAR研究队列中6例来自成对的多区域肿瘤活检或来自不同转移部位的两个肿瘤样本的RNA测序数据。对于所有患者(P)，每个患者的两个肿瘤样本具有相同的转录亚型，无论是从肺、卵巢或淋巴结提取的多区域样本，还是从P3患者的淋巴结和颈部提取的样本，这些数据证明了单个肿瘤的亚型同质性(在所有5名多区域取样的患者中均可观察到)，并暗示了转移过程中的亚型稳定性(基于1名患者的数据)。
图2A
作者对这6例患者中的4例(P2、P4、P5、P6)进行了靶向测序， P4的两个样本均携带TP53突变；P5只有一个样本是TP53突变，同时还有RB1和SRC突变；P6有一个样本发生了CDKN2A缺失。有趣的是，来自P2的两个样本都有STK11和NFE2L2突变，而仅在一个样本发生KRAS和KEAP1突变。
图2B
总的来说，这些数据表明，尽管关键肿瘤抑制基因在多区域样本中存在基因组亚克隆性，但在多区域样本中转录亚型是稳定的。
5.体外和体内模型系统反映人肺腺癌亚型
作者评估了175个NSCLC细胞系，其中29%(48/168)为KRAS突变株(补充表S5)，66%能被归属为某一亚型(116/175) (图3A;补充图S5A和S5B)。KRAS突变率在不同亚型中相似(30%-37%)，KRAS热点突变率在不同亚型中无差异。为了不局限于一种模型系统，作者还研究了232个肺癌的体内PDX模型，其中54%(126)可归属于某一亚型(图3A)。
无论是体外(细胞系)还是体内(PDX)模型中，肿瘤抑制基因STK11、CDKN2A或TP53的遗传突变在三种亚型中没有显著性差异(图3B)。
图3A-B
补充图S5A-B
尽管缺乏亚型和遗传事件之间的联系，我们观察到在细胞系和PDX模型中，STK11突变在PRO亚型中呈高表达(图3C)，黏液分化基因在MUC亚型中呈高表达 (图3D)。
图3C-E
此外，作者对10个鼠类肿瘤队列(GEMM KP)进行了聚类分析，发现了两个稳定强大的亚型：鼠亚型1和鼠亚型2（图3A,补充图S5C-D），鼠亚型1和2分别主要捕获MUC和PRO亚型（补充图S5E）。与人亚型相似，STK11突变在鼠亚型2中呈高表达(图3C)，黏液分化基因在鼠亚型1中呈高表达 (图3D)。此外，组织学分析显示具有高粘蛋白生成和杯状细胞分化作用的鼠类肿瘤中有70％被归类为亚型1（图3E）。因此，鼠亚型1和2也被称为粘液型和增生型。
图S5C-E
6. 利用体外、体内和临床试验数据证明亚型特异性治疗脆弱性的概念
接下来，作者在89种具有亚型注释的肺癌细胞系中，用526种化合物进行了小分子筛选。若一种化合物和亚型呈负相关，说明该亚型细胞系对该化合物敏感。结果显示，6种MEK1/2和6种ERK抑制剂属于PRO亚型细胞株不敏感化合物，但属于MUC亚型细胞株和少量MES亚型细胞株敏感化合物(图4A-B，补充图S6A)。
图4A-B
为了验证亚型对MAPK治疗的敏感性的体外发现，作者在GEMM KP队列中，使用MEK抑制剂卡比替尼(cobimetinib)对荷瘤动物进行了14天的药效实验，结果显示，暴露于cobimetinib 的19种肿瘤中有12种肿瘤具有类似于PRO亚型的转录图谱，4种肿瘤具有类似于MUC亚型的转录图谱(图4C)，这被PRO亚型肿瘤中较高水平的STK11突变特征所证实(补充图S6B)。与未经治疗的肿瘤相比， cobimetinib治疗显著地将残留肿瘤中PRO亚型的比例提高至75％（图4C）。
补充图S6A-B
为了进一步分析MAPK治疗反应与转录亚型的关系，作者构建了小鼠肺癌PDX模型(19例KRAS突变型和18 例KRAS野生型)，采用cobimetinib或媒介物对照治疗，其中10个是MUC亚型模型，7个PRO亚型模型和10个MES亚型模型（补充表S6），结果显示，cobimetinib治疗后，PRO亚型获益最少，MES亚型获益最多（图4D）。
图4C-D
总之，体外数据以及PDX体内数据均证实，转录异质性对靶向治疗药物具有独特的治疗意义，尤其是跨多种临床前模型的MAPK治疗反应，并没有被KRAS信号或STK11丧失作为不良预后的因素所混淆。
为了进一步验证临床前研究的适用性，作者利用gp28363研究队列中22例非鳞状NSCLC患者的肿瘤组织RNA测序数据，结果发现，22个肿瘤中的20个可以被分配给三种亚型（补充表S9）。亚型之间的无进展生存期（PFS）显著不同（图4E），MES亚型肿瘤患者PFS在联合治疗中表现最佳，这在KRAS突变型和KRAS野生型肿瘤中均得到了一致的观察。与其他亚型相比，MES亚型肿瘤部分反应（PR）的发生率较高，而进行性疾病（PD）的发生率较低（图4F），这与我们在PDX试验中用cobimetinib治疗的MES亚型肿瘤中观察到的最高TGI一致。
图4E-F
重要的是，在OAK队列中，接受atezolizumab治疗的患者的PFS在各个亚型中始终较低，而不论其KRAS状态如何（补充图S6C）。OAK队列中各亚型的肿瘤突变负担也无显著性（补充图S6D）。因此，在gp28363 Ib期试验中观察到的PFS亚型特异性和反应性差异（图4E和F）至少可以部分归因于cobimetinib。
补充图S6A
这些数据表明，与黏液或增生性肿瘤相比，MEK抑制剂联合检查点阻滞治疗局部晚期或转移性间质肿瘤获益显著更多，而这种效果是由cobimetinib介导的。
参考文献
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