科研 | 血细胞计数板的使用方法

一、实验器材

普通光学显微镜、血球计数板、吸水纸、盖玻片、吸管、移液枪、枪头、离心管、镊子（取用盖玻片）、无水乙醇或 95% 乙醇溶液、

如果需要将细胞进行稀释需要加入培养基吗？还是生理盐水，缓冲溶液都可？

二、实验步骤

血球计数板的准备：取血球计数板，检测血球计数板是否清洁，如果有污垢，应先洗涤干净并擦干。用无水乙醇或 95% 乙醇溶液擦拭计数板后，用绸布擦净，另擦净盖玻片一张。先在低倍镜下，熟悉计数板和计数区的构造。

加盖玻片，盖住血球计数板两边的小槽。

制备细胞悬液：将动物细胞用稀释液制备成适当浓度的细胞悬液备用。

（如果需要染色，需要在充液之前将染色液按照一定的比例加入细胞悬液中）

充液: 用滴管或者移液器将一小滴震荡混匀的稀释的细胞悬液滴在盖玻片边缘的玻片上，细胞悬液借毛细管现象自动渗入计数室中。如果加入的液体过多，会进入计数取两侧的凹槽内，使盖玻片浮起，需要用滤纸把多余的液体吸出。

避免滴入过少细胞悬液，易产生气泡。如果加入的过少，需要洗净计数板，干燥后重做。

充液后静置1-2min，待细胞下沉后，方可计数。

先用低倍镜找到血球计数器的计数区。

计数结束后，清洗计数板，整理试验台。

三、计数原理

 1、熟悉血细胞计数板的计数区

  2、计数时只计数中央

  3、细胞浓度计算

  细胞浓度计算公式：

  细胞浓度(细胞个数/mL) = (80小方格内细胞个数÷80)×400×104×稀释倍数

  4、细胞计数原则

计数区每个中方格内16个小方格要依次计数，遵循 S形计数原则。

在计数靠近中方格边线（为双线）的细胞时，遵循“计上不计下，计左不计右”原则。

如发现各中方格中的细胞数目相差20个以上，表明细胞分布不均匀，须重新计数。

四、实验注意事项

血球计数板为易碎品，请务必轻拿轻放。

检查计数板，确保清洁。

方格网的分隔线无色，在相差显微镜下更容易看到。

充液时，避免滴入过多细胞悬液，溢出并流入两侧槽内，使盖玻片浮起。避免滴入过少细胞悬液，易产生气泡。

计数时，只计数完整的细胞，若聚成一团的细胞则按一个细胞进行计数。

二次重复计数误差不应超过 ±5%

如果细胞数量较多的情况下，可取一滴（或100ul）细胞混悬液＋八滴（或800ul）细胞培养液＋一滴（或100ul）苔盼蓝，这样最终稀释倍数为十倍。

五、染色计数

如果需要了解细胞生活状态和鉴别细胞死活，确定细胞接种浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度，如用酶消化制备的细胞悬液中细胞活力的鉴别，冻存细胞复苏后的活力检测等。

细胞悬液制备后，常用活体染料台盼蓝对细胞进行染色，进行细胞计数。台盼蓝不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色。而死亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细胞内而使细胞着色（蓝色）。

1、用滴管吸取 0.4% 台盼蓝染液，按 1∶1 比例加入细胞悬液中。

2、镜下观察，凡折光性强而不着色者为活细胞，染上蓝色者为死细胞。

3、计数细胞后，计算细胞悬液浓度并求出存活与死亡细胞数的比例。

参考网址：

https://www.icourse163.org/learn/XMU1207467801tid=1207788203#/learn/contenttype=detail&id=1213913014&cid=1217906593（中国大学慕课-细胞与显微技术实验课程）

http://paper.dxy.cn/article/501668（丁香园-献给初学者：手把手教你做细胞计数实验）

文章文字稿整理自中国大学慕课