1.3质控结果解读

以最差的一个为例

总览

本批次QC中最差的一个

绿色勾勾：合格的
黄色叹号：触到了警戒线
红色叉叉：不合格

1.基础数据

结果1

reads长度=150
GC含量=47%
reads数9.4kw

illumina可以达到2X150bp。reads长度符合仪器标准，GC含量符合理论

2.某一位置上所有读段的测序质量评分

结果2

绿（合格）、黄（警戒）、红（不合格）

3.每次荧光扫描的质量

结果3

蓝色表示测序质量很高，暖色表示测序质量不高。当某些tail出现暖色，在后续的分析种把该tail测序结果全部去除。

4.读段的质量得分分布情况

结果4

序列长度为151bp，那么这151个位置每个位置Q值的平均值就是这条reads的质量值。该图横轴是0-40，表示Q值。

从图中可以看到红线为单峰（窄而高），并且分值在36（>>20），所以每条reads的可靠性很高。

5.每个位置的4种碱基的比例图

5

G%比值不太对，而且不太配对...

四条线总体平行行走于25%水平线说明总体质量可以，问题出在前10个位置，四条线严重分离，说明有碱基偏向性，很可能就是接头序列。

6.GC含量分布图

6

果然是GC含量偏高

7.每个位置上N的比例

7

红线接近0,说明几乎所有位置都被识别为ATCG之一。

8.读段长度分布

8

所有reads长度都是150

9.序列重复的水平

9

重复次数为一次的比例越高越好。统计序列完全一致的reads的频率，横轴表示重复的次数，纵轴表示重复的reads的数目。一般测序深度越高，越容易产生一定程度的重复序列。

10.序列重复的水平

10

大量超过0.1%的重复，通过ncbi blast发现支原体污染....

支原体污染

如果有某个序列大量出现，就叫做over-represented。fastqc的标准是占全部reads的0.1%以上。和上面的duplicate analysis一样，为了计算方便，只取了fq数据的前200,000条reads进行统计，所以有可能over-represented reads不在里面。而且大于75bp的reads也是只取50bp。如果命令行中加入了-c contaminant file，出现的over-represented sequence会从contaminant_file里面找匹配的hit（至少20bp且最多一个mismatch），可以给我们一些线索。当发现超过总reads数0.1%的reads时报”WARN“，当发现超过总reads数1%的reads时报”FAIL“。https://www.jianshu.com/p/dacedb7f6e2f

11.每一位置上是常用接头序列的比例

11

横轴表示碱基位置，纵轴表示百分比。当fastqc分析时没有选择参数-a adapter list时，默认使用图例中的4种通用adapter序列进行统计。若有adapter残留，后续必须去接头。

12.结果分析

GC含量偏高，重复序列过多，原因可能有两个，一个是支原体污染，一个是adapter残余

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参考文献

要充分了解你的测序数据--论QC的重要性http://www.biotrainee.com/thread-324-1-1.html
FastQC的基本介绍https://www.jianshu.com/p/fe6af418a8bc
FastqC结果简介https://blog.csdn.net/gateswell/article/details/78858579
(3)转录组之数据质控https://www.jianshu.com/p/2ed3622ed4a8

如何处理fastqc报告中duplication level报错的问题https://www.bioinfo.info/?/question/21

首先，对于FastQC duplication衡量的问题，应该先考虑是什么建库方式。是DNA重测序，还是RNA-Seq，如果是RNA-Seq duplication level报警是很容易的，因为很多gene存在多拷贝的情况。其次，那么这个duplication到底严不严重，或者后续怎么处理呢，目前没有唯一的定论。但是有这么几个原则：
[]RNA-Seq一般不去duplication，除非是设计了UMI或者random barcode，如果设计了这些序列，在reads水平进行去duplication，单端reads推荐seqkit工具，双端测序推荐UniqFast去reads的duplication；[/][]DNA-Seq一般在比对完以后，用picard 里面的MarkDuplicates 模块去duplication；[/][]DNA测序中，酶切打断一般去duplication，超声打断一般不去 duplication；[/][]常见的ChIP-Seq不需要去duplication。