转录组测序原理

参考：

https://www.bilibili.com/video/BV1XJ411r7bJ/?spm_id_from=333.788.videocard.0

定义

而转录组测序即是利用高通量测序技术，将细胞或组织中的全部或部分mRNA, miRNA, lnc RNA 进行测序分析的技术。

RNA-seq 应用

通过RNA-seq，也就是转录组测序，可以帮助我们了解各种比较条件下所有基因的表达差异包括：

正常组织与肿瘤组织；

药物治疗前后的表达差异；

发育过程中，不同发育阶段，不同组织的表达差异……

不仅可以检测，RNA 表达的差异，还有RNA 结构的差异。

转录组的主要目的之一便是寻找 基因表达的差异 。

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测序方法（Truseq-RNA）

原始RNA样本清理

由于获取的RNA 大部分都是rRNA，只有2%, 3% 是mRNA 及其余的lncRNA, tRNA, miRNA 等。

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因此主要用于RNA-seq 测定的mRNA 只占了很小的比例。而获得的大部分的RNA，tRNA 在各个物种和组织中是非常保守的，如果不是特别测定，一般不会得到什么有效信息。

RNA 建库过程

介绍illumina 的Truseq-RNA 建库方法。

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1）杂交

利用真核生物mRNA 尾部PolyA 修饰的特性，进行杂交。

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2）打成短序列

将磁珠回收，也就筛选出了mRNA，再对这些片段洗脱，并打成短片段。

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3）逆转录

将短片段的RNA 进行逆转录，获得第一链cDNA。

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4）合成双链

利用引物合成双链cDNA。

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5）连接接头与扩增

到这一步，就和一般的基因测序一样了。

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再进行扩增，也就建立了标准的测序文库。

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接着就可以拿去测序了。

RNA 质量要求

RNA 必须要有比较高质量，因为开始的杂交是连接3' 的序列，因此如果mRNA 发生了降解，则远离3' 端的序列就很容易被洗脱掉了。

质量检测

根据两个峰的质量进行打分（RIN 值，最高10分，建议8分以上），通常来说这两个峰值越高越尖，打分越高，质量也越高。

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数据分析

比对

将测序数据比对到基因组上。

质量控制

通常通过检测比对后的RNA 分布进行判断。

检测RNA 片段有多少在3' 位置，又有多少在5' 位置。

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如果左边显著不如右边饱满，则可能大部分的mRNA 发生了降解。

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RPKM值(标准化处理)

具体计算参考：https://www.yuque.com/mugpeng/nwmnq7/cf7lm6

本质上就是一个数值的标准化处理。

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差异分析

火山图对比不同样本的基因表达量对比。横轴反映差异的大小，纵轴反映差异的显著性。

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相同差异大小的样本，可能由于其样本统计数的差异，因而造成了显著性的差异（置信程度，结果更可信）。

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聚类分析

对基因表达进行分群，可以找出它们的共同或不同特征。

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富集分析

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可以将差异基因富集到不同功能上，探寻它们的功能特性。

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从上到下基因的功能定义越来越精准，颜色越深，其富集程度越高。

通路分析

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结构变异检测

建议测序数据在10G 以上，以保证测序的覆盖度。

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可变剪接

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一般人类样本，可以发现5000～20000个可变剪接。

融合基因

融合基因指，某个基因头融合到了其他基因的身体上。

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点突变

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RNA-seq综述

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