【文献01】m6A修饰增强mRNA的相分离

文献：Ries, R. J., Zaccara, S., Klein, P., Olarerin-George, A., Namkoong, S., Pickering, B. F., ... & Jaffrey, S. R. (2019). m6A enhances the phase separation potential of mRNA. Nature, 571(7765), 424-428.

相关同类型文献：
Dynamic m6A methylation facilitates mRNA triaging to stress granules

一、背景知识

Q1. 生物细胞的相分离是什么？

相分离或者相变（Phase separation）, 描述的是一种细胞里不同成分间，像液滴一样，可以相互碰撞、融合形成液滴，从而使一些成分被包裹在液滴内，一些成分被阻隔在液滴外的现象。如P颗粒蛋白，好似油醋汁里的油滴，剧烈摇晃之后分散成很小的液滴，而后又很快地融合形成大液滴，这个过程被称为“液-液相分离”。细胞内的 “相分离”，形成的液滴可以形成特定环境加速生物学反应，也可以将不需要的物质隔离开。而这种“相分离”的异常，可能造成疾病（在植物中这种相分离异常会怎样呢？）

细胞内的液-液相分离

Q2. 什么是临界溶解温度(lower critical solution temperature)?

临界溶解温度：是聚合物溶液发生相分离的临界温度，如果聚合物在某一温度以下溶解，而在此温度以上聚合物溶液出现相分离，那么这个温度就称为最低临界溶解温度(lower critical solution temperature, LCST )；与之相反，如果聚合物在某一温度以上溶解，而在此温度以下时聚合物溶液发生相分离，这个温度则称为最高临界溶解温度(upper critical solution temperature, UCST )

Q3. P-body是什么？

细胞质加工小体或称P小体（英文中书写为Cytoplasmic processing bodies或P-bodies），通过浓缩细胞质中的酶参与mRNA的更新，同时屏蔽了众多不需要翻译的mRNA链使它们远离翻译蛋白。事实上，P小体是细胞质中不连续的区域，当中存在很多参与转录后过程的细胞因子，例如参与mRNA的降解、翻译的抑制、mRNA的监控和RNA干涉等过程的细胞因子都可能在P小体中出现。

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摘要：

• 细胞质m6A结合蛋白-YTHDF1（简称DF1）, YTHDF2(简称DF2) 和 YTHDF3(简称DF3)-在细胞内和细胞外发生“液-液相分离”；
• 含有多个m6A修饰的mRNA，显著加强这种“相分离”；
• 多甲基化的mRNA作为共价支架结合YTHDF蛋白，将其低复杂度结构域并置，从而导致相分离。
• 产生的mRNA–YTHDF复合物分配到不同相分离的区室中，例如P-body，应激颗粒或神经元RNA颗粒。m6A-mRNA受到区室特异性调控，包括mRNA稳定性和翻译降低。

  也就是说，当mRNAs上存在多个m6A标记的时候，m6A结合蛋白质趋于”黏合”在一起，（又或称为螯合作用, 携带多个m6A标记的mRNAs充当一个多化合价“骨架”的角色，使YTHDF蛋白能够结合上来，构成RNA-蛋白螯合物）。这种螯合作用接下来会促使细胞内一些液滴状隔离区室的形成(m6A表观修饰所诱导的细胞内“相分离”现象)，将YTHDF蛋白与和它们结合在一起的mRNAs隔离在区室内,如细胞质处理小体 (P-bodies)、应激颗粒(stress granules) 或神经元RNA颗粒 (neuronal RNA granules) 。

“我们的研究结果表明m6A标记的一个重要功能是在细胞应激过程中，诱导某些mRNA的储存。许多这些m6A标记的RNA编码细胞修复蛋白，因此这看起来细胞修复过程在应激期间以这种方式受到抑制，但是细胞不再遭受损伤并且适合于启动修复时，这种抑制就会被解除。” by Samie Jaffre

结果

  朊蛋白结构域(prion-like domains): 朊病毒蛋白（PRION）是生物体正常基因编码的产物，本不具有感染性和致病性，但是遗传突变可以产生传染型朊病毒，可以将正常的朊病毒异构为传染型朊病毒，其因为结构特殊，无法被细胞内溶酶体中的蛋白酶分解，而在溶酶体中大量积累，最终涨破溶酶体，使其中的蛋白酶流出而对细胞造成破坏，使神经细胞大量死亡而产生海绵状空洞。疯牛病、羊瘙痒症、库鲁病都是由朊病毒引起。归根结底，朊粒是正常寄主的PrP基因编码的正常蛋白质PrP^c 的异构体PrP^sc， 它不是遗传信息的载体，不能自我复制，只是感染动物体内正常的PrP^c。
  Prion-like domains (PLDs)，是在与神经退行性疾病肌萎缩性侧索硬化症相关的RNA结合蛋白中发现的低复杂性序列。即，朊蛋白样结构域（prion-like domains）能够诱导蛋白发生相变，相变液滴进一步“硬化”会形成病理性的纤维状聚集。最近，PLDs 发现通过驱动核糖核蛋白颗粒组装的液相转变来介导基因调控。

1. 多甲基化m6A的RNA触发DF蛋白液-液相分离

图1. 多甲基化m6A的RNA触发DF蛋白液-液相分离

• a. 缓冲液中，包含DF2重组蛋白的试管中，当温度从4℃ 加热到37°C，DF2蛋白发生相分离，当温度冷却时(4℃ )，这种相分离的凝聚效应消失；
• b. 当温度以每分钟1°C的速度升高(22°C至37°C)，可形成蛋白质液滴。而温度逐渐降低到22°C又会导致液滴分解。
• c. 不同浓度的NaCl条件下，DF2的相变化示意图。表明盐会抑制蛋白质的相分离潜能。绿色圆圈表示存在蛋白质滴；粉色方块表示在缓冲液中未观察到蛋白滴。
• d. 免疫染色，Alexa488–DF2在1分钟内通过荧光显微镜成像。
• e. 上图：光漂白后Alexa488–DF2液滴的荧光强度随时间的变化曲线。从荧光测量中减去背景。黑色曲线表示不同液滴中感兴趣的光漂白区域中荧光强度的平均值（n = 8）；灰色条表示s.e.m.下图是荧光恢复的代表性图像。
• f. 包含10个m6A修饰的RNA(65bp长)诱导DF2迅速形成小液滴，而包含一个m6A修饰或不包含m6A的RNA不会引起DF2相分离。
• g. 左图: 添加包含10个m6A位点的RNA增强了溶液中DFs（15μM）的相分离。 右图：存在和不存在包含10个m6A位点的RNA时，DF的分配系数（PC）。 对于无RNA的条件，在添加含m6A的RNA之前立即计算分配系数(右图：无RNA，平均PC = 1.0;DF1,n = 8;DF2,n = 10;DF3,n = 9;总计,n = 27)。 在添加包含10个m6A核苷酸的RNA后不久，测量了DF蛋白的分配系数，并且平均DF分配系数显着增加。

2. DF蛋白具有液体特征，并在胁迫时重新定位

图2. 细胞中DF蛋白表现出液体特征，并在胁迫条件下重新定位

• a. 42°C热激30分钟，mES细胞中DF2(红色)和应激颗粒maker TIAR(绿色)进行免疫共染色。
• b. 亚砷酸钠（0.5 mM）处理1h,mES细胞中DF2(红色)和应激颗粒maker TIAR(绿色)进行免疫共染色。
• c. 使用CRISPR–Cas9 knock-in 和亚砷酸盐处理(0.5 mM，1 h),HEK293细胞中NeonGreen–DF2的内源表达。NeonGreen–DF2被分配进亚砷酸盐诱导的应激颗粒。应激颗粒光漂白之后，荧光迅速恢复，表明NeonGreen–DF2可以在细胞中活跃地发生相分离。 线迹表示平均分数荧光
• d. 热应激后(42℃，30分钟), mES细胞中的应激颗粒maker DF2（红色）和P-body maker EDC4（绿色）的共免疫染色发现P-body与应激颗粒非常接近,但不共定位。

3. m6A增强DF蛋白分配进入细胞内相分离区室的能力

m6A增强DF蛋白分配进入细胞内相分离区室的能力

• a. 热激（42°C，30分钟）或亚砷酸盐（0.5 mM，30分钟）处理后，使用应激颗粒maker TIAR（绿色）和DF2（红色）共免疫染色，结果显示，DF2在Mettl14基因敲除的mES细胞中的重新定位被延迟了。
• b. 野生型和Mettl14基因敲除的mES细胞在应激颗粒中的DF2荧光强度比率（TIAR染色的颗粒内部的DF2强度/与TIAR染色的颗粒紧邻的细胞质中的DF2强度）显示Mettl14敲除细胞中的DF2共定位延迟。
• c. 热激（42°C，30分钟）后，m6A30对应激颗粒定位的亲和力降低约十倍，DF2突变体(DF2(W432A))中定位收到损害。 W432A突变破坏了DF2中结合m6A的色氨酸笼。
• d. 野生型mES细胞中P-bady maker EDC4（绿色）和DF2（红色）免疫共染色显示l两者之间有明确的重叠。但在Mettl14基因敲除细胞中，这种共定位显着降低，DF2看起来更弥散地呈胞质状。

4. 具有m6A修饰mRNA，富集在不同包含DF的RNA颗粒中

具有m6A修饰mRNA，富集在不同包含DF的RNA颗粒中

• a. 从富集不溶性应激颗粒部分和总NIH3T3细胞提取物中，对其ploy(A) RNA的m6A水平，通过薄层色谱法定量检测。结果显示，在应激颗粒中，m6A水平显著增加。
• b. U2OS亚砷酸盐诱导的应激颗粒中mRNA富集的累积分布图，该图显示按每个转录本注释的m6A峰数分类的mRNA。相对于总细胞RNA，在应激颗粒中，没有发现未甲基化的转录本。 但，包含两个或多个m6A峰的转录本在应激颗粒中富集，并且这种富集与m6A位点的数量成比例。
• c. 与未甲基化的mRNA相比，含m6A的mRNA在应激颗粒中富集度更高。
• d. 缺少m6A注释位点的两个mRNA（Grk6和Polr2a), 与长度和丰度相似的含m6A的mRNA匹配（Fignl1和Fem1b，每个包含四个m6A位点）。 Grk6和Polr2a未富含应激颗粒。 Fignl1和Fem1b在热激胁迫后的应激颗粒中显着富集，占总smFISH点数的一部分。
• e. 通过RNA测序确定热激之前和之后（42°C，30分钟）mRNA表达水平。对于非甲基化，单甲基化和多甲基化的m6A-mRNA，转录本丰度保持不变。
• f. 通过匹配的核糖体表达谱和RNA测序数据计算热激前的翻译效率。并且，对处于甲基化状态（即在野生型细胞中）与未甲基化状态（即在Mettl14-敲除细胞）中，每一个mRNA热激前的翻译效率进行比较。
• g. 野生型和Mettl14基因敲除的mES细胞，经过30分钟热激处理(42°C)，然后37°C恢复1 h的翻译效率。只有多甲基化的转录本显示翻译效率明显降低。

实验方法

细胞、酶和化学试剂

HEK 293T/17: 人胚肾细胞, 293T/17细胞株是293T细胞株的衍生株，293T细胞进行克隆，检测pBND和pZAP载体，得到一株能生成高滴度感染逆转录病毒的衍生株293T/17细胞。293T/17细胞持续表达猿病毒40（SV40）大T抗原，而因其高转染能力筛选到17号克隆。

U2OS: 人骨肉瘤细胞；U2OS是由Ponten J和Saksela E在1964年从一名15岁女孩的胫骨中等分化的肉瘤中分离建立的。该细胞表达胰岛素样生长因子Ⅰ、Ⅱ（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）受体和骨肉瘤衍生生长因子（ODGF）。

NIH3T3: 是由美国国立卫生研究院所建立的小鼠胚胎成纤维细胞系，其特点是每3天传代一次，每次接种3×10^5cells/ml。 该细胞系在实验室常用来做转染及基因表达的研究。

RNase T1酶
  核糖核酸酶T1为一内切核糖核酸酶。它特异地作用于鸟嘌呤核苷酸(G)3'端磷酸并切割与相邻核苷酸相连的磷酸二酯键。反应的终产物为鸟嘌呤核苷3'磷酸及末端带鸟嘌呤核苷3'磷酸的寡核苷酸。

嘌呤霉素（Puromycin）
  嘌呤霉素是一种由白黑链霉菌产生的氨基苷类抗生素。其可以打乱核糖体上的肽转运，造成翻译过程中不成熟链终止，从而抑制蛋白质合成。在原核和真核细胞中，嘌呤霉素都是强效翻译抑制剂。链霉菌中的嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因（pac）可使机体对嘌呤霉素耐药。嘌呤霉素作用迅速，在低浓度下即可快速导致细胞死亡。贴壁哺乳细胞对浓度为2-5 µg/ml的嘌呤霉素较为敏感，而悬浮细胞对浓度低至0.5-2 µg/ml的嘌呤霉素已经很敏感。对嘌呤霉素稳定耐药的哺乳细胞可在一周内生成。
Actinomycin D
（放线菌素D）可浓度依赖性的减少DNA的修复活性，IC50值为0.42 μM。Actinomycin D（dactinomycin），actinomycines的成员，是一类从链霉菌属的土壤细菌中分离的多肽类抗生素。多年来用作化疗剂，actinomycin D与双链和单链DNA结合，通过与转录起始复合物中的DNA结合，阻止RNA聚合酶对RNA链的延伸，从而抑制DNA和RNA的合成。体外实验：在原代培养24小时的离体大鼠脂肪细胞中评估actinomycin D对瘦素释放的效应，结果表明，actinomycin D（放线菌素D）和dexamethasone（地塞米松）在24小时的孵育后均减少瘦素mRNA的损失。对瘦素释放和瘦素mRNA积累的最大效应仅需要0.1 μM的actinomycin D，而该浓度在24小时的孵育后对脂肪细胞中18S RNA的含量没有显著效果。与瘦素mRNA损失的减少相比，在0.1 μM的actinomycin D存在时，甘油醛-3-磷酸脱氢酶信使核糖核酸（GAPDH mRNA）的损失增加了。这些结果表明，actinomycin D特异性地调节瘦素释放和瘦素mRNA的水平。体内实验：在大鼠中，actinomycin D对群体峰电位时程的效应比对EPSP组件时程的效应更显著，表明对两种形式的电位具有不同的机制。而且，通过测量群体峰的幅度，actinomycin D通过海马和侧脑室注射后可阻止齿状回中LTP的晚期阶段

胁迫处理：

(1) Arsenite stress

亚砷酸盐：因其能与-SH特异性结合故能抑制二硫键还原酶的活性，亚砷酸盐可以引起细胞应激，导致应激颗粒的形成。本研究中，0.5 mM 亚砷酸钠（Na3AsO3）处理30-60mins 用作亚砷酸盐胁迫研究。As有正三价和正五价,即有还原性,也有氧化性.
NaAsO2，(砷离子为+5价，具有氧化性)

(2) Thapsigargin stress

毒胡萝卜素（Thapsigargin，TG）：是一种非竞争性，细胞膜渗透性的SERCAs介导的钙离子转运抑制剂（Ca2+-ATPase ），是一种表征良好的内质网应激诱导剂。文章中胁迫处理使用10 μM 处理mES细胞3 h 或者5 μM处理NIH3T3 细胞 1.5 h。

免疫染色

实验过程：细胞贴壁生长-->收集细胞-->多聚甲醛固定-->渗透和封闭细胞-->一抗孵育-->与耦合有荧光的二抗孵育Alexa Fluor 488（绿色）或Alexa Fluor 594（红色）-->细胞核使用Hoechst 33342染色（DNA蓝色荧光染料）-->固定剂固定盖玻片

EDC4: P-body marker
DCP1A:P-body marker
TIAR: stress-granule marker
G3BP1: stress-granule marker
ATXN2: a well- characterized stress granule marker