使用EDTA进行TE注释

一句话评价：重复序列注释用EDTA就完事了。

简介

EDTA, 全称是 Extensive de-novo TE Annotator, 一个综合性的流程工具，它整合了目前LTR预测工具结果，TIR预测工具结果，MITE预测工具结果，Helitrons预测工具结果, 从而构建出一高可信，非冗余的TE数据库，用做基因组的注释。流程图如下

EDTA流程

安装

如果没有管理员权限，可以用conda进行安装。如果有管理员权限，可以尝试用docker或者singularity进行安装。

conda

使用conda的安装方法如下

conda create -n EDTA
conda activate EDTA
python2 -m pip install --user numpy==1.14.3 biopython==1.74 pp
conda config --env --add channels anaconda --add channels conda-forge --add channels biocore --add channels bioconda --add channels cyclus
conda install -n EDTA -y cd-hit repeatmodeler muscle mdust repeatmasker=4.0.9_p2 blast-legacy java-jdk perl perl-text-soundex multiprocess regex tensorflow=1.14.0 keras=2.2.4 scikit-learn=0.19.0 biopython pandas glob2 python=3.6 trf
git clone https://github.com/oushujun/EDTA
./EDTA/EDTA.pl

需要注意的一点是，bioconda建议添加国内镜像站点, 否则可能会下载失败。

singularity

方法1: 使用EDTA上提供的docker镜像，以singularity进行安装

singularity build edta.sif docker://kapeel/edta

在使用时，有一点需要注意，需要用-B将外部的RepeatMasker的Libraries绑定的Libraries，否则可能会在检查依赖这一步失败。

这里，我参考的是LoReAN的方法

cd ~ # 切换到家目录
mkdir -p LoReAn && cd LoReAn
wget https://github.com/lfaino/LoReAn/raw/noIPRS/third_party/software/RepeatMasker.Libraries.tar.gz && tar -zxvf RepeatMasker.Libraries.tar.gz
singularity exec \
    -B /home/xzg/LoReAn/Libraries/:/opt/conda/share/RepeatMasker/Libraries/ \
    /home/xzg/edta.sif /EDTA/EDTA.pl -h

上面的/home/xzg/是我的家目录，需要根据实际情况进行选择

方法2: 使用 @wangshun1121 构建的docker镜像, 他解决了需要-B进行挂载的问题。

singularity build edta.sif docker://registry.cn-hangzhou.aliyuncs.com/wangshun1121/edta

实战

我们以拟南芥的第一条染色体为例，进行介绍

# singularity
singularity exec ~/LoReAn/edta.sif /EDTA/EDTA.pl \
    -genome chr1.fa -species others -step all -t 20
# conda
# 我的EDTA在我的家目录下
~/EDTA/EDTA.pl -genome chr1.fa -species others -step all -t 20

这里的参数比较简单,

-genome: 输入的基因组序列
-species: 物种名，Rice, Maize和others三个可选
-step: 运行步骤, all|filter|final|anno, 根据具体情况选择
-t: 线程数，默认是4

此外还有几个参数可以关注下

-cds: 提供已有的CDS序列（不能包括内含子和UTR），用于过滤
-sensitive: 是否用RepeatModeler分析剩下的TE，默认是0，也就是不要。RepeatModeler运行时间比较久，量力而信。
-anno: 是否在构建TE文库后进行全基因组预测，默认是0.

运行结束之后，会在当前目录下留下运行时的中间文件，保证你程序中断之后，能够断点续跑

xxx.EDTA.raw
xxx.EDTA.combine
xxx.EDTA.final

以及你关注的xxx.EDTA.TElib.fa, 这就是最终的TE文库。

可能问题

我在使用EDTA时，就遇到了两个问题。一个是singularity的EDTA直接使用时无法通过依赖检测，解决方法已经在安装部分提过，这里不在赘述。

另一个问题我在"Identify TIR candidates from scratch"这一步出现下面的报错

what():  terminate called after throwing an instance of 'Resource temporarily unavailable std::system_error'
what():  Resource temporarily unavailable
terminate called after throwing an instance of 'std::system_error'

我对这个报错进行了相近的分析，找到了对应代码，即sh $TIR_Learner -g $genome -s $species -t $threads -l $maxint. 用实际内容替换变量后，即下面这行代码

sh /EDTA/bin/TIR-Learner2.4/TIR-Learner2.4.sh -g chr.fa -s others -t 20 -l 5000

更具体一点，可以将问题定位到脚本的Module 3, Step 3: Get dataset

genomeFile=/data/xzg_data/1800_assembly/annotation/repeatAnnotation/chr.fa #基因组文件的实际路径
genomeName=TIR-Learner
tir_path=/EDTA/bin/TIR-Learner2.4 # TIR-Learner2.4的路径
t=1
dir=`pwd`
export OMP_NUM_THREADS=1
python3 $tir_path/Module3_New/getDataset.py -g $genomeFile -name $genomeName -p $tir_path -t $t -d $dir"/Module3_New"

将线程数设置为1后，该代码顺利跑通。进一步，我定位getDataset.py的出问题的地方实际是predict函数。当然接着执行后续的代码，发现改动这一参数并不影响下面代码的运行。

echo "Module 3, Step 4: Check TIR/TSD"
python3 $path/Module3_New/CheckTIRTSD_M3.py -name $genomeName -p $path -t $t -d $dir"/Module3_New"
echo "Module 3, Step 5: Write to Gff"
python3 $path/Module3/WriteToGff_M3.py -name $genomeName -p $path -t $t -d $dir"/Module3_New"

我发现predict函数涉及到了Python的多进程调用，最终在偶然间找到问题真正所在，即Linux系统对用户的资源限制，可以通过ulimit -a查看。

最终我通过设置ulimit -u 9000，提高允许运行的总程序数，将问题解决。

参考资料

EDTA官方文档
RMblast的问题
一个关于fork资源不够的解决过程
Ou, S., Su, W., Liao, Y., Chougule, K., Agda, J.R.A., Hellinga, A.J., Lugo, C.S.B., Elliott, T.A., Ware, D., Peterson, T., et al. (2019). Benchmarking transposable element annotation methods for creation of a streamlined, comprehensive pipeline. Genome Biology 20, 275.

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