4+内质网应激+预后模型教你如何应用到自己的生信分析研究中。

今天给同学们分享一篇内质网应激+预后模型的生信文章“Characteristics of endoplasmic reticulum stress in colorectal cancer for predicting prognosis and developing treatment options”，这篇文章于2023年3月31日发表在Cancer Med期刊上，影响因子为4。

越来越多的证据支持内质网应激（ERS）在结直肠癌（CRC）中起着重要作用。在本研究中，作者开发了一个与ERS相关的基因（ERSRGs）模型，以帮助评估和治疗CRC患者的预后。

1. ERSRGs的富集分析

首先，作者在GeneCard数据库中搜索关键词“内质网应激”，以识别一组ERSRGs。使用|log2FC| = 0.585和FDR <0.05作为阈值进行基因表达水平比较，共检测到220个DEGs。然后对DEGs的富集进行分析，GO和KEGG结果显示主要与内质网、内质网腔、ERS、内质网蛋白质加工、免疫相关信号通路和CRC相关。这些结果表明ERS在CRC的发展中起着关键作用。

2. 筛选EERSRGs并构建风险评分模型

对220个差异表达基因进行了单变量Cox回归分析，发现了与预后相关的26个基因（p < 0.05）（图1A）。首先，总结了样本中ERSRGs的体细胞突变情况。在541个带有突变信息的CRC样本中，共有115个ERSRGs发生了突变，突变频率为21.26%（图1B）。ATP2A1、PARGC1A和CNGA3的突变率≥4%，其中ATP2A1的突变率最高，达到了5%。然而，LEP、CXCL1、HAMP、C3orf70、SNCG、UTS2和NOL3在CRC样本中的突变率没有显著变化。重要的是，在与预后相关的26个ERSRGs中存在显著的共同突变特征（图1C）。此外，作者分析了这些ERSRGs的拷贝数变化，并观察到这些基因的拷贝数变化频率存在显著差异，FABP4、TERT、C3orf70和ADIPOQ的拷贝数增加，而NGF、UTS2、GRP和SNCG的拷贝数减少，共同表明ERSRGs的异常表达（图1D、E）。鉴于ERS在CRC中的重要作用，作者试图开发一个ERS预后风险评分模型，以更准确地评估CRC患者的状况。构建风险评分模型所涉及的CRC样本的临床信息如表1所示。然后通过LASSO Cox回归分析筛选出16个基因（DDIT3、TERT、PPARGC1A、ATP2A1、GRP、TRAP1、CD36、CXCL1、TRPV3、UTS2、OGT、NOL3、STC2、BDNF、TIMP1和C3orf70）来构建模型（图1F,G）。根据风险评分的中位数将训练集中的高风险组（n = 270）和低风险组（n = 270）进行划分。验证集以相同的方式划分，主成分分析（PCA）显示该模型能够有效地将CRC样本分为高风险和低风险组（图1H，I）。

图1 建立ERS风险评分模型

3. 训练集和验证集样本的风险预测和生存状态

从数据集中生成了风险曲线，其中风险评分可视化了两组患者的风险评分（图2A、B）。分析发现高风险组患者的预后较差，随着风险评分的增加，死亡率也增加（图2C、D）。接下来，风险直方图在风险评分模型中直观评估了生存状态。低风险评分的患者生存率显著较高，进一步证明该模型能够准确地分层患者。此外，作者使用热成像技术比较了影响患者预后的ERSRGs在两个风险组之间的表达水平。BDNF、GRP、CD36、TIMP1、DDIT3、OGT、STC2、ATP2A1、NOL3、TERT、TPRV3和UTS2在高风险组中表达水平较高，而PPARGC1A、C3orf70、CXCL1和TARP1的表达水平较低（图2E、F）。作者还发现这些基因之间存在显著关联。

图2 ERS模型中患者的风险预测以及模型中包含的基因表达水平

4. 模型的预测能力

在训练集中，高风险组的OS低于低风险组（p < 0.001）（图3A）。使用ROC曲线验证模型对患者OS的预测效果，1年、3年和5年的AUC结果分别为0.72、0.76和0.77（图3B）。为了检查模型的可靠性，作者在验证集（GSE40967）上进行了测试。高风险组的患者OS较低于低风险组（p < 0.001）（图3C）。验证集的AUC值如图3D所示。为了进一步验证预后模型的准确性，作者在GSE17538数据集中再次验证（p < 0.005）。结果显示高风险组患者的OS较低，并且ROC的AUC值表现良好（图3E，F）。通过计算，作者的模型的R平方约为0.70，这表明作者的预后风险评分模型的预测能力是可接受的。

图3 ERS预后风险模型与临床病理特征之间的关系及其对生存的预测价值

5. 预测模型的预测性能比较

为了验证ER应激预后风险评分模型的优越性，通过ROC将之前结直肠癌研究中的模型与作者的模型进行比较。第一个是研究脂质代谢的模型，根据研究者的名字称之为杨氏标志。第二个是研究甲基化的模型，称之为谭氏标志。第三个是研究免疫相关基因的模型，称之为温氏标志。第四个是研究脂肪酸代谢的模型，称之为丁氏标志。根据模型中的基因，作者使用R软件包进行ROC分析。结果显示，作者构建的ERS预后风险评分模型在1年、3年和5年的AUC值均高于其他四个模型（图4A-D）。这意味着作者的风险评分模型具有更好的预测性能。

图4 不同预后模型的预测性能

6. 临床病理特征与风险评分的关联

由于不同的临床病理特征对疾病预后有不同的影响，因此还探讨了风险评分模型中临床病理特征的分布情况。结果表明，风险评分与肿瘤进展最为密切相关。尽管风险评分在年龄或性别上没有显著差异（图5A、B），但随着TNM分期和病理分期的升高，风险评分也随之增加（图5C-F）。接下来，比较了风险评分、年龄、性别和病理分期对预后的预测能力，结果显示风险评分的AUC值最高（0.786），表明风险评分具有最佳的预测能力（图5G）。C-指数显示风险评分的表现优于其他临床特征，预测结果的准确性更高（图5H）。图5I、J显示年龄和风险评分是OS的独立预测因子（p < 0.001）。

图5 风险评分模型与临床特征之间的关系

7. 构建预测生存率的诺莫图

通过将性别、风险评分、病理分期和年龄从训练集中结合起来，构建了一个预测结直肠癌(OS)的图表模型（图6A）。1年、3年和5年的校准曲线展示了该图表模型的准确性（图6B）。Cox回归分析最终揭示了只有图表模型是独立的预测因子（p < 0.05）（图6C、D）。图6E-G展示了风险评分、图表模型、年龄、性别和病理分期在1年、3年和5年的AUC，其中图表模型的AUC分别为0.780、0.812和0.823，最高（图6H-J）。DCA分析包含了1年、3年和5年的各种临床病理特征。树状图直观地显示了预后风险评分模型的图表模型在1年、3年和5年的DCA曲线中表现最佳。

图6 通过整合训练集中的ERS风险评分和临床病理特征，创建了一个用于预测CRC预后的图表

8. 化疗的反应和相关基因表达的变化

由于结直肠癌（CRC）患者常规在手术后接受化疗，因此探索了模型中患者对化疗药物的反应。使用R软件中的“pRRophetic”分析了风险评分与化疗治疗效果之间的关联。低风险组样本对5-FU的治疗效果较好，而随着风险评分的增加，IC50也增加（图7A、B）。进展无病生存期（PFS）在训练集的亚组之间也显示出显著差异，表明风险评分可以对化疗耐药患者进行分层（p < 0.001）（图7C）。突变型BRAF和TP53以及野生型APC的风险评分较高（图7D-G）。此外，与m6A相关的大多数基因在ERS预后风险评分模型中差异显著，如YTHDF2、YTHDF3、FTO、METTL4、RTCB、GPM6A、SRSF3和CAPRIN1，这些基因可能有助于寻找化疗耐药的治疗靶点（图7H）。

图7 ERS预后风险评分模型在化疗中的作用

9. ERS预测模型中的免疫相关特征

ESTIMATE评分（p < 0.001），免疫评分（p < 0.05）和基质评分（p < 0.001）在两组之间存在显著差异，表明ERS深刻影响免疫和基质细胞浸润（图8A）。图8B、C显示了免疫评分和基质评分与风险评分的相关性。接下来，使用不同软件研究了侵袭性免疫细胞的风险评分。此外，作者发现高风险组中免疫抑制细胞浸润更为丰富，调节性T细胞（Tregs）水平较高，这与高风险组的生存劣势一致，而低水平浸润的T细胞CD4记忆静止（p < 0.001），静止树突状细胞（p < 0.01），活化树突状细胞（p < 0.001）和浆细胞（p < 0.001）（图8D）。在先前的报告中，I型干扰素（IFN-I）信号的激活可以使肿瘤患者从免疫疗法中受益。在本研究中，高风险组中IFN-I反应得到增强，这意味着免疫抑制患者可以通过免疫疗法改善预后（图8E）。为了预测结直肠癌患者对免疫治疗的反应，进一步研究了免疫检查点与内质网应激反应（ERS）之间的相关性（图8F）。作者的研究结果显示，ERS风险评分与大多数免疫检查点呈正相关，如PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）、CTLA-4、LAG3、TIGIT和HAVCR2（TIM-3）。此外，作者发现高风险组中PD-1、TIGIT、TIM-3和CTLA-4的表达较高。通过免疫治疗队列，探索了ERS风险模型预测结直肠癌预后的能力。结果显示，在没有任何免疫治疗的情况下，高风险组患者对免疫治疗的反应明显较差，并且当仅使用针对CTLA4的免疫治疗时，这一结果仍然存在（图8G，H）。此外，作者获得了训练集的TIDE预测分数，并在ERS风险组之间进行了分析。随着TIDE预测分数的增加，预后结果下降，再次表明低风险组具有更好的预后。接下来，对模型的不同亚组进行免疫抑制基因表达的分析显示，高风险组中大多数免疫抑制基因的表达水平增加，这可能解释了该组患者免疫治疗效果不佳。

图8 ERS预后风险评分模型中的免疫相关特征

10. 模型中差异表达基因的功能富集分析和蛋白质相互作用网络

为了更好地理解基因的作用，对两个风险组的差异表达基因进行了功能富集分析。GO结果显示这些基因参与了包括细胞外区域、细胞外区域分数、结构分子活性、分子功能调节因子、内质网和细胞外结构组织等通路（图9A）。KEGG分析显示了人乳头瘤病毒感染、ECM-受体相互作用、吞噬体、PI3K-Akt信号通路、WNT信号通路、PPAR信号通路和雌激素信号通路等术语的显著富集（图9B）。在线网站STRING用于研究风险组中差异表达基因的蛋白质相互作用，并生成了PPI网络（图S4A）。使用Cytoscape软件对PPI数据进行可视化处理，上调和下调基因的表达分别以红色和绿色标记（图9C）。然后使用Cytoscape的插件cytoHubba对差异表达基因中的中心基因进行筛选，排名前10位如图9D所示。随后比较了正常组织和肿瘤组织中中心基因的差异。结果显示，SPP1、COMP、THBS2、SERPINE1和COL11A1在肿瘤组织中高表达，而MYH11、TAGLN和CNN1低表达。预后价值分析显示，在上述八个具有统计学差异的中心基因中，只有SPP1、TAGLN、COMP、SERPINE1、COL11A1和CNN1的mRNA表达会影响预后（图9E-H），其中SPP1、COMP、SERPINE1和COL11A1的水平与不良预后具体相关。为了验证SPP1、COMP、SERPINE1和COL11A1在正常和CRC组织之间的差异表达，对11名CRC患者的正常和肿瘤活检标本进行了q-PCR检测（图9I-L）。

图9 PPI网络的可视化

总结

本研究提供了一种新的、准确的预测CRC患者预后的方案。鉴于作者模型的显著预后能力和准确的治疗结果预测，作者的风险评分模型可以作为患者选择治疗的新工具。考虑到ERS在CRC中的重要性，有必要对其具体作用机制进行更深入的研究。